基因原系统

1. 网络等级是不是分为八个等级是哪八个等级

3级深网.onion结尾，4级宪章网络，5级马里亚纳网络.lock结尾，6级深层政治.lll结尾，7级，战争七区，8级基因原系统

2. 真核生物基因表达系统有什么特点

和原核细胞相比真核基因表达系统在时间和空间上都是隔开的。
1、真核生物DNA转录成RNA后，要经过加工，切除内含子转录来的部分才能成为成熟的mRNA，而原核生物基因没有外显子与内含子之分。
2、真核生物mRNA要从核孔出来，与细胞质中的核糖体结合才能指导蛋白质合成，原核细胞没有核膜，所以不存在空间的阴隔。
所以，真核细胞的基因表达和原核基因的表达有区别。
以上从高中知识层面分析。

3. 急用！一论述题:如何克隆一个功能性基因，如何在原核系统中高效表达

你的题目关键是解决两个问题：一是功能性基因在原核生物中的表达；二是如何高效进行表达。
帮你在网上找到一入篇相关的文章。节选相关性较大的内容如下，有需要的话，你追问我给你链接，因为网络会吞掉带有链接的回复。

============================================================
1、原核生物只有一种RNA 聚合酶（真核细胞有三种）识别原核细胞的启动子，催化所有 RNA的合成。
2、原核生物的表达是以操纵子为单位的。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。调控区主要分为三个部分：操纵基因、启动子及其他有调控功能的部位。
3、功能性基因一般是真核生物所具有的基因，而真核生物基因基本具有外显子和内含子等结构。原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统，因此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成 mRNA 前体后，其中内含子部分不能被切除。
4、原核生物基因的控制主要在转录水平。这种控制要比对基因产物的直接控制要慢，对RNA 合成的控制有两种方式：一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。
5、在大肠杆菌（大多工程菌都是使用大肠杆菌）mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3'末端碱基互补的序列，即 SD 序列，而真核基因则缺乏此序列。因此，真核基因本身的mRNA前端部分不能直接使用，需要进行一定的修饰。

将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和 SD 序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：
⑴通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；
⑵外源基因不能带有内含子，因而必须用 cDNA 或全化学合成基因，而不能用基因组 DNA；
⑶必须利用原核细胞的强启动子和 SD序列等调控元件控制外源基因的表达；
⑷外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(open reading frame)；
⑸利用宿主细胞的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达对宿主菌的毒害。

大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的表达系统，由于待表达的外源基因结构具有多样性，尤其是真核生物基因的结构与大肠杆菌基因结构之间存在较大的差异，因而在构建表达系统时必须具体情况具体分析。一般来说，高效表达外源基因必须考虑以下基本原则：
①优化表达载体的设计。为了提高外源基因的表达效率，在构建表达载体时对决定转录起始的启动子和决定 mRNA 翻译的SD序列进行优化。具体方法包括组合强启动子和强终止子；增加 SD 序列中与核糖体 16S rRNA 互补配对的碱基因序列，使 SD 序列中6～8 个碱基与核糖体16S rRNA 的碱基完全配对；根据待表达外源基因的不同情况调整 SD 序列与起始密码子 ATG 之间的距离及碱基的种类；防止核糖体结合位点附近序列转录后形成“茎环”二级结构。
②提高稀有密码子 tRNA 的表达作用。多数密码子具有简并性，而不同基因使用密码子的频率不相同。大肠杆菌基因对某些密码子的使用表现了较大的偏爱性，在几个同义密码中往往只有一个或两个被频繁地使用。同义密码子使用的频率与细胞内相应的 tRNA 的丰度呈正相关，稀有密码子的tRNA在细胞内的丰度很低。在 mRNA的翻译过程中，往往会由于外源基因中含有过多的稀有密码子而使细胞内稀有密码子的 tRNA供不应求，最终使翻译过程终止或发生移码突变。此时可通过点突变等方法将外源基因中的稀有密码子转换为在受体细胞中高频出现的同义密码子。
③提高外源基因 mRNA 的稳定性。大肠杆菌的核酸酶系统能专一性地识别外源 DNA或 RNA并对其进行降解。对于 mRNA 来说，为了保持其在宿主细胞内的稳定性，可采取两种措施，一是尽可能减少核酸外切酶可能对外源基因 mRNA的降解，二是改变外源基因 mRNA 的结构，使之不易被降解。
④提高外源基因表达产物的稳定性。大肠杆菌中含有多种蛋白水解酶，在外源基因表达产物的诱导下，蛋白水解酶的活性可能会增加。因此，须采用多种措施提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性。常用的方法包括：将外源基因的表达产物转运到细胞周质或培养基中；选用某些蛋白水解酶缺陷株作为受体菌；对外源蛋白中水解酶敏感的序列进行修饰或改造；在表达外源蛋白的同时，表达外源蛋白的稳定因子。
⑤优化发酵过程。在发酵罐内工程菌生长到一定的阶段后，开始诱导外源基因的表达，诱导的方式包括添加特异性诱导物和改变培养温度等。使外源基因在特异的时空进行表达不仅有利于细胞的生长代谢，而且能提高表达产物的产率。生物因素的第三方面是提高外源基因表达产物的总量。外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。在保持单个细胞基因表达水平不变的前提下，提高菌体密度可望提高外源蛋白质合成的总量。

4. 转基因技术的原理是什么

答：转基因技术是利用现代生物技术，将人们期望的目标基因，经过人工分离、重组后，导入并整合到生物体的基因组中，从而改善生物原有的性状或赋予其新的优良性状。除了转入新的外源基因外，还可以通过转基因技术对生物体基因的加工、敲除、屏蔽等方法改变生物体的遗传特性，获得人们希望得到的性状。这一技术的主要过程包括外源基因的克隆、表达载体构建、遗传转化体系的建立、遗传转化体的筛选、遗传稳定性分析和回交转育等。

5. 基因的历史

1983年首次获得转基因烟草、马铃薯

附：
21世纪，高科技发展的热点之一是现代生物技术中的遗传工程。遗传工程有狭义和广义之分：狭义遗传工程就是基因工程；广义的遗传工程是指所有能改变生物体遗传性状的技术。遗传工程起始于70年代，首先是分子生物学家研究并掌握了分割和拼接遗传物质脱氧核糖核酸（DNA）的技术，其后应用到各个方面。通过这种技术，已经可以使细菌产生胰岛素和人类生长激素，提高乳牛产奶量，还能将抗御病虫害的特殊基因注入到马铃薯、玉米、棉花等农作物中。近年来医务界已治愈了几种可能致人于死地的酶缺乏症（几种遗传病），并且几乎每周都能发现引发某种疾病的基因……生物技术正在以另人目不暇接的速度和不可思议的方式改变着这个世界。1996年诺贝尔奖获得者、莱斯大学的化学家罗伯特·柯尔说：“本世纪是物理学和化学的世纪，但下个世纪显然将是生物学的世纪。”

认识基因

将外源遗传物质人工地转移到受体生物中，使受体生物获得新的遗传属性，这一工序叫做遗传工程。基因工程是分子水平上的遗传工程，是专指来自不同生物的基因（称目的基因）同有自主复制能力的载体DNA在体外人为地连接，建成新的重组DNA，然后送入受体生物去繁殖和表达，从而达到遗传物质和性状的转移和重新组合。为区别于一般遗传工程，现在常用基因工程一词，也称为基因操作、基因克隆增殖、重组DNA技术。基因工程的主要程序包括目的基因的取得，载体的选择，限制酶等酶系的选用，体外重组体的构建、转化，以及目的基因在受体细胞里的增殖与表达。

“基因”到底是什么呢？

现在我们通用的“基因”一词，是由“GENE”音译而来的。基因原称遗传因子，这一概念由来已久，例如斯宾塞的“生理单位”，达尔文的“微芽”，魏斯曼的“定子”等都是为了企图说明世代之间性状遗传机理的早期遗传因子的假说。

1865年，奥地利原天主教神父、遗传学家约翰·格雷戈尔·孟德尔（1822―1884年）根据豌豆七对不同性状的杂交实验，总结出遗传因子的概念以及在生殖细胞成熟中同对因子分离、异对因子自由组合两条遗传规律，也就是人们称为的孟德尔因子和孟德尔定律。他发现了遗传基因原理，总结出分离规律和自由组合规律，为遗传学提供了数学基础，创立了孟德尔学派，由此成为“遗传学之父”。

“基因”是丹麦的植物学家和遗传学家威·约翰逊1909年首先提出来用以表达孟德尔的“遗传因子”这一概念的。从1910年到30年代美国人托马斯·亨特·摩尔根（1866―1945年）等通过数百种果蝇性状的杂交实验，结合细胞学的观察，不仅证明了孟德尔定律的正确性，而且还发现了基因连锁和交换显象及其染色体机理，同时还证实了长期存在的一种猜测，即借助于显微镜能看到的在细胞核里呈小棍形状结构的染色体就是基因的所在地。他阐明了基因变异和遗传的染色体机理，总结为基因学说。

但是，当时人们还没有弄清楚基因到底是什么。40年代以来遗传学研究逐步提高到分子水平，40－60年代，经过许多科学家的实验研究，肯定了基因的化学成分主要为DNA，阐明了DNA的双螺旋结构以及双股DNA之间碱基互补配对原则，人们才在以后的研究中，越来越清楚地认识了“基因”及其在遗传中的作用。

基因是具有遗传效应的DNA分子片段，它存在于染色体上，并在染色体上呈线性排列。基因不仅可以通过复制把遗传信息传递给下一代，还可以使遗传信息得到表达，也就是使遗传信息以一定方式反映到蛋白质的分子结构上，从而使后代表现出与亲代相似的性状。

根据遗传学研究，一般都认为一条染色体只含有一条DNA双螺旋；如果染色体已分裂为两个染色单体，那么每一个单体含有一条DNA双螺旋。但是染色体的宽度要比DNA双链大得多，而染色体的长度又比DNA双链短得多。据统计，人的染色体总长不到半毫米，而DNA分子的总长却可达数米，所以在染色体中的DNA双链总是缠绕又缠绕，呈高度地盘曲的状态。

在染色体中高度盘曲着的DNA分子是一条很长的双链，最短的DNA分子中大约也含有4000个核苷酸对，最长的大约含有40亿个。一个DNA分子可以看作是很多区段的集合，这些区段一般不互相重叠，大约各有500－6000个核苷酸对，这样的一个区段就是一个基因。

那么，基因的内部结构是什么样的，科学家又是如何确定它的呢？

实际上，在遗传学发展的早期阶段“基因”仅仅是一个逻辑推理概念，而并非一种已经得到证实了的物质和结构。在本世纪30年代，由于证明了基因是以直线的形式排列在染色体上，因此人们认为基因是染色体上的遗传单位。随着分子遗传学的发展，1953年在沃森和克里克提出DNA的双螺旋结构以后，人们普遍认为基因是DNA的片段，确定了基因化学本质。大多数生物的基因是由DNA组成，而DNA则是染色体的主要化学成分。大多数真核生物细胞内的DNA是由双股多核苷酸单链结合而成。每股DNA链又是由许多个单核苷酸借磷酸二酯键互相连接而成；而两股之间则是依靠两者的碱基成分按互补规律分别配对结合，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）借两个氢键连接，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）借三个氢键连接，形成一条双螺旋梯形结构，故称为DNA双螺旋。本世纪60年代，本茨又提出了基因的内部具有一定的结构，可以区分为突变子、互换子和顺反子三个不同的单位。DNA分子上的一个碱基变化可以引起基因突变，因此可以看成是一个突变子；两个碱基之间可以发生互换，可以看成是一个互换子；一个顺反子是具有特定功能的一段核苷酸序列，作为功能单位的基因应该是顺反子。因此从分子水平来看，基因就是DNA分子上的一个片段，经过转录和转译能合成一条完整的多肽链。可是，通过近来的研究，科学家认为这个结论并不全面，因为有的基因在转录出RNA后，不再翻译成蛋白质。另外，还有一类基因，如操纵基因，它们既没有转录作用，又没有翻译产物，仅仅起着控制和操纵基因活动的作用。特别是近年来，科学家发现DNA分子上有相当一部分片段，只是某些碱基的简单重复。这类不含有遗传信息的碱基片段，在真核细胞生物中数量可以很大，甚至达到50％以上。关于DNA分子中这些重复碱基片段的作用，目前还不十分了解。有人推测可能有调节某些基因活动和稳定染色体结构的作用，其真正的功能尚待研究。由此，目前有遗传学家认为，应把基因看作是DNA分子上具有特定功能的（或具有一定遗传效应的）核苷酸序列。

基因的结构有以下几个特点：

1）基因是结构单位，不能由交换分开，交换只能发生在基因之间，而不在它们之中。2）基因是突变单位，基因可以从一个等位形式变为另一个等位形式，但在基因内部没有可以改变的更小的单位。3）基因是作用单位，能产生一种特定的表型效应，基因的部分，如果有的话，不能起作用。4）染色体是基因的载体，染色体的存在，使等位基因可以有规则分离，又可以使非等位基因间相互重组。

基因的功能

基因有控制遗传性状和活性调节的功能。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，并通过控制酶的合成来控制代谢过程，从而控制生物的个体性状表现。基因还可以通过控制结构蛋白的成分，直接控制生物性状。

生物体细胞中的DNA分子上有很多基因，但并不是每一基因的特征都表现出来。即使是由同一受精卵发育分化而来的同一人体不同组织中的细胞，如肌肉细胞、肝脏细胞、骨细胞、神经细胞、红细胞、和胃黏膜细胞等。它们的细胞形状都是各不相同的。为什么会出现这种现象呢？原来，细胞核中的基因在细胞的一生中并非始终处于活性状态，它们有的处于转录状态，即活性状态，这时基因打开，有的处于非转录状态，即基因关闭。在生物体的不同发育期，基因的活性是不同的，而且基因的活性有严格的程序。基因活性的严格程序是生命周期稳定的基础。各种不同的生物因其细胞内的基因具有独特的活性调节而呈现不同的形态特征。

那么，基因是如何决定性状的呢？

生物体的一切遗传性状都受基因控制，但是基因并不等于性状，从基因型到表现型（性状）要经过一系列的发育过程。基因控制生物的性状主要通过两条途径，一是通过控制酶的合成来控制生物的性状。这是因为由基因控制的生物性状要表现出来，必需经过一系列的代谢过程，而代谢过程的每一步都离不开酶的催化，所以基因是通过控制酶的合成来控制代谢过程，从而控制生物个体性状的表现的。另一条途径是基因通过控制结构蛋白的成分直接控制生物的形状。蛋白质多肽链上氨基酸序列都受基因的控制，如果控制蛋白质的基因中DNA的碱基发生变化，则可引起信使RNA上相应的碱基的变化，从而导致蛋白质的结构变异。

此外，遗传性状的表现，不但要受到内部基因的控制，还受到外部花茎条件的制约。因此，不同基因型的个体在不同的环境条件下可以产生不同的表现型，即使同一基因型的个体，在不同环境条件下，也可以产生不同的表现型。也就是说，表现型是基因型与环境共同作用的结果。

国际上生物技术发展的新动向

基因疗法

随着人类对基因研究的不断深入，发现许多疾病是由于基因结构与功能发生改变所引起的。科学家将不仅能发现有缺陷的基因，而且还能掌握如何进行对基因诊断、修复、治疗和预防，这是生物技术发展的前沿。这项成果将给人类的健康和生活带来不可估量的利益。

所谓基因治疗是指用基因工程的技术方法，将正常的基因转如病患者的细胞中，以取代病变基因，从而表达所缺乏的产物，或者通过关闭或降低异常表达的基因等途径，达到治疗某些遗传病的目的。目前，已发现的遗传病有6500多种，其中由单基因缺陷引起的就有约3000多种。因此，遗传病是基因治疗的主要对象。

第一例基因治疗是美国在1990年进行的。当时，两个4岁和9岁的小女孩由于体内腺苷脱氨酶缺乏而患了严重的联合免疫缺陷症。科学家对她们进行了基因治疗并取得了成功。这一开创性的工作标志着基因治疗已经从实验研究过渡到临床实验。1991年，我国首例B型血友病的基因治疗临床实验也获得了成功。

基因治疗的最新进展是即将用基因枪技术于基因治疗。其方法是将特定的DNA用改进的基因枪技术导入小鼠的肌肉、肝脏、脾、肠道和皮肤获得成功的表达。这一成功预示着人们未来可能利用基因枪传送药物到人体内的特定部位，以取代传统的接种疫苗，并用基因枪技术来治疗遗传病。目前，科学家们正在研究的是胎儿基因疗法。如果现在的实验疗效得到进一步确证的话，就有可能将胎儿基因疗法扩大到其它遗传病，以防止出生患遗传病症的新生儿，从而从根本上提高后代的健康水平。

基因工程药物研究

基因工程药物，是重组DNA的表达产物。广义的说，凡是在药物生产过程中涉及用基因工程的，都可以成为基因工程药物。在这方面的研究具有十分诱人的前景。

基因工程药物研究的开发重点是从蛋白质类药物，如胰岛素、人生长激素、促红细胞生成素等的分子蛋白质，转移到寻找较小分子蛋白质药物。这是因为蛋白质的分子一般都比较大，不容易穿过细胞膜，因而影响其药理作用的发挥，而小分子药物在这方面就具有明显的优越性。另一方面对疾病的治疗思路也开阔了，从单纯的用药发展到用基因工程技术或基因本身作为治疗手段。

现在，还有一个需要引起大家注意的问题，就是许多过去被征服的传染病，由于细菌产生了耐药性，又卷土重来。其中最值得引起注意的是结核病。据世界卫生组织报道，现已出现全球肺结核病危机。本来即将被消灭的结核病又死灰复燃，而且出现了多种耐药结核病。据统计，全世界现有17.22亿人感染了结核病菌，每年有900万新结核病人，约300万人死于结核病，相当于每10秒钟就有一人死于结核病。科学家还指出，在今后的一段时间里，会有数以百计的感染细菌性疾病的人将无药可治，同时病毒性疾病日益曾多，防不胜防。不过与此同时，科学家们也探索了对付的办法，他们在人体、昆虫和植物种子中找到一些小分子的抗微生物多肽，它们的分子量小于4000，仅有30多个氨基酸，具有强烈的广普杀伤病原微生物的活力，对细菌、病菌、真菌等病原微生物能产生较强的杀伤作用，有可能成为新一代的“超级抗生素”。除了用它来开发新的抗生素外，这类小分子多肽还可以在农业上用于培育抗病作物的新品种。

加快农作物新品种的培育

科学家们在利用基因工程技术改良农作物方面已取得重大进展，一场新的绿色革命近在眼前。这场新的绿色革命的一个显著特点就是生物技术、农业、食品和医药行业将融合到一起。

本世纪五、六十年代，由于杂交品种推广、化肥使用量增加以及灌溉面积的扩大，农作物产量成倍提高，这就是大家所说的“绿色革命”。但一些研究人员认为，这些方法目前已很难再使农作物产量有进一步的大幅度提高。

基因技术的突破使科学家们得以用传统育种专家难以想象的方式改良农作物。例如，基因技术可以使农作物自己释放出杀虫剂，可以使农作物种植在旱地或盐碱地上，或者生产出营养更丰富的食品。科学家们还在开发可以生产出能够防病的疫苗和食品的农作物。

基因技术也使开发农作物新品种的时间大为缩短。利用传统的育种方法，需要七、八年时间才能培育出一个新的植物品种，基因工程技术使研究人员可以将任何一种基因注入到一种植物中，从而培育出一种全新的农作物品种，时间则缩短一半。

虽然第一批基因工程农作物品种5年前才开始上市，但今年美国种植的玉米、大豆和棉花中的一半将使用利用基因工程培育的种子。据估计，今后5年内，美国基因工程农产品和食品的市场规模将从今年的40亿美元扩大到200亿美元，20年后达到750亿美元。有的专家预计，“到下世纪初，很可能美国的每一种食品中都含有一点基因工程的成分。”

尽管还有不少人、特别是欧洲国家消费者对转基因农产品心存疑虑，但是专家们指出，利用基因工程改良农作物已势在必行。这首先是由于全球人口的压力不断增加。专家们估计，今后40年内，全球的人口将比目前增加一半，为此，粮食产量需增加75％。另外，人口的老龄化对医疗系统的压力不断增加，开发可以增强人体健康的食品十分必要。

加快农作物新品种的培育也是第三世界发展中国家发展生物技术的一个共同目标，我国的农业生物技术的研究与应用已经广泛开展，并已取得显著效益。

分子进化工程的研究

分子进化工程是继蛋白质工程之后的第三代基因工程。它通过在试管里对以核酸为主的多分子体系施以选择的压力，模拟自然中生物进化历程，以达到创造新基因、新蛋白质的目的。

这需要三个步骤，即扩增、突变、和选择。扩增是使所提取的遗传信息DNA片段分子获得大量的拷贝；突变是在基因水平上施加压力，使DNA片段上的碱基发生变异，这种变异为选择和进化提供原料；选择是在表型水平上通过适者生存，不适者淘汰的方式固定变异。这三个过程紧密相连缺一不可。

现在，科学家已应用此方法，通过试管里的定向进化，获得了能抑制凝血酶活性的DNA分子，这类DNA具有抗凝血作用，它有可能代替溶解血栓的蛋白质药物，来治疗心肌梗塞、脑血栓等疾病。

我国基因研究的成果

以破译人类基因组全部遗传信息为目的的科学研究，是当前国际生物医学界攻克的前沿课题之一。据介绍，这项研究中最受关注的是对人类疾病相关基因和具有重要生物学功能基因的克隆分离和鉴定，以此获得对相关疾病进行基因治疗的可能性和生产生物制品的权利。

人类基因项目是国家“863"高科技计划的重要组成部分。在医学上，人类基因与人类的疾病有相关性，一旦弄清某基因与某疾病的具体关系，人们就可以制造出该疾病的基因药物，对人类健康长寿产生巨大影响。据介绍，人类基因样本总数约10万条，现已找到并完成测序的约有8000条。

近些年我国对人类基因组研究十分关注，在国家自然科学基金、“863计划”以及地方政府等多渠道的经费资助下，已在北京、上海两地建立了具备先进科研条件的国家级基因研究中心。同时，科技人员紧跟世界新技术的发展，在基因工程研究的关键技术和成果产业化方面均有突破性的进展。我国人类基因组研究已走在世界先进行列，某些基因工程药物也开始进入应用阶段。

目前，我国在蛋白基因的突变研究、血液病的基因治疗、食管癌研究、分子进化理论、白血病相关基因的结构研究等项目的基础性研究上，有的成果已处于国际领先水平，有的已形成了自己的技术体系。而乙肝疫苗、重组α型干扰素、重组人红细胞生成素，以及转基因动物的药物生产器等十多个基因工程药物，均已进入了产业化阶段。

基因技术：进退两难的境地和两面性的特征

基因作物在舆论界引发争议不足为怪。但在同属发达世界的大西洋两岸，转基因技术的待遇迥然不同却是一种耐人寻味的现象。当美国40％的农田种植了经过基因改良的作物、消费者大都泰然自若地购买转基因食品时，此类食品在欧洲何以遭遇一浪高过一浪的喊打之声？

从直接社会背景看，目前欧洲流行“转基因恐惧症”情有可原。从1986年英国发现疯牛病，到今年比利时污染鸡查出致癌的二恶英和可口可乐在法国导致儿童溶血症，欧洲人对食品安全颇有些风声鹤唳，关于转基因食品可能危害人类健康的假设如条件反射一般让他们闻而生畏。

同时，欧洲较之美国在环境和生态保护问题上一贯采取更为敏感乃至激进的态度，这是转基因食品在欧美处境殊异的另一缘故。一方面，欧洲各国媒介的环保意识日益强烈，往往对可能危害环境和生态的问题穷追不舍甚至进行夸张的报道，这在很大程度上左右着公众对诸如转基因问题的态度。另一方面，以“绿党”为代表的“环保主义势力”近年来在欧洲政坛崛起，在政府和议会中的势力不断扩大，对决策过程施加着越来越大的影响。

但是，欧洲人对转基因技术之所以采取如此排斥的态度，似乎还有一个较为隐蔽却很重要的深层原因。实际上，在转基因问题上欧美之间既有价值观念之差，更是经济利益之争。与一般商品不同，转基因技术具有一种独特的垄断性。在技术上，美国的“生命科学”公司一般都通过生物工程使其产品具有自我保护功能。其中最突出的是“终止基因”，它可以使种子自我毁灭而不能象传统作物种子那样被再种植。另一种技术是使种子必须经过只为种子公司所掌握的某种“化学催化”方能发育和生长。在法律上，转基因作物种子一般是通过一种特殊的租赁制度提供的，消费者不得自行保留和再种植。美国是耗资巨大的基因工程研究最大的投资者，而从事转基因技术开发的美国公司都熟谙利用知识产权和专利保护法寻求巨额回报之道。美国目前被认为已控制了相当大份额的转基因产品市场，进而可以操纵市场价格。因此，抵制转基因技术实际上也就是抵制美国在这一领域的垄断。

生物技术在许多领域正在发挥越来越重要的作用：遗传工程产品在农业领域无孔不入，遗传工程作物开始在美国农业中占有重要位置；生物技术在医学领域取得显著进展，已有一些遗传工程药物取代了常规药物，医学界在几方面从基因研究中获利；克隆技术的进展为拯救濒危物种及探索多种人类疾病的治疗方法提供了前所未有的机会。目前研究人员正准备将生物技术推进到更富挑战性的领域。但近来警惕遗传学家的行为的声音越来越受到重视。

今天，人们借助于所谓的DNA切片已能同时研究上百个遗传基质。基因的研究达到了这样一个发展高度，几年后，随着对人类遗传物质分析的结束，人们开始集中所有的手段对人的其他部分遗传物质的优缺点进行有系统地研究。但是，生物学的发展也有其消极的一面：它容易为种族主义提供新的遗传学方面的依据

对新的遗传学持批评态度的人总喜欢描绘出一幅可怕的景象：没完没了的测试、操纵和克隆、毫无感情的士兵、基因很完美的工厂工人……遗传密码使基因研究人员能深入到人们的内心深处，并给他们提供了操纵生命的工具。然而他们是否能使遗传学朝好的研究方向发展还完全不能预料。

6. 大肠杆菌作为外源基因表达系统有哪些优缺

大肠杆菌是原核生物，不过dna少易操作;
酵母菌是真核生物，dna结构和表达更接近人类，而且相对易培养(相对动物细胞);
不过前两者都是模式生物，遗传结构相当清晰;
动物细胞是最接近人类的，基因表达过程与人基本一致，但实际操作相对困难。
一般是在前两者上找到目的基因，最后在后者检验效果。

7. 遗传基因与免疫系统有什么联系

大多数的原发性免疫缺陷并就和遗传基因有联系。
原发性免疫缺陷者有高度伴发自身免疫病的倾向，正常人群自身免疫病的发病率为0.001%～0.01%，而免疫缺陷者可高达14%，以系统性红斑狼疮、类风湿关节炎和恶性贫血等较多见。
多数原发性免疫缺陷病有遗传倾向性，约1/3为常染色体遗传，1/5为性染色体隐性遗传。
某些原发性免疫缺陷病为单基因缺陷所致，一些突变位点已经明确，从而为未来基因治疗奠定了基础。将正常的目的基因片段整合到患者干细胞基因组内（基因转化），被基因转化的细胞经过有丝分裂，使转化的基因片段能在患者体内复制而持续存在，并发挥功能。理论上讲，凡骨髓移植成功的疾病均是基因治疗的指征。

8. 原核系统中影响外源基因表达效率的主要因素

影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素？ 浏览次数：904次悬赏分：0 | 提问时间：2009-4-28 17:30 | 提问者：lys2126
影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素？

推荐答案 ⑴外源基因的拷贝数
⑵ 外源基因的表达效率
①启动子的强弱
②核糖体接合位点的有效性
③SD序列和起始密码ATG的间距
④密码子组成
⑶表达产物的稳定性
⑷细胞代谢负荷
⑸工程菌的培养条件

设计构建一个载体，将目的基因在植物根系表达并向根细胞外分泌。请详细写出个步骤 浏览次数：842次悬赏分：20 | 解决时间：2009-2-14 09:13 | 提问者：370629225
考研的 问题
最佳答案 先给你贴个东西你先看一下 希望对你有帮助
将特定的外源基因构建在植物表达载体中并转入受体植物，并不是植物遗传转化的最终目的。理想的转基因植物往往需要外源基因在特定部位和特定时间内高水平表达，产生人们期望的表型性状。然而，近二十年的发展历史却表明，外源基因在受体植物内往往会出现表达效率低、表达产物不稳定甚至基因失活或沉默等不良现象，导致转基因植物无法投入实际应用。另外，转基因植物的安全性问题已在许多国家引起人们的关注，例如，转基因有可能随花粉扩散，抗生素筛选标记基因有可能使临床上的某些抗生素失去作用等等。以上问题的出现使得植物基因工程这一高新技术正处于一种前所未有的困扰时期。针对这些问题，近几年人们对植物转基因技术进行了多方面的探索和改进，植物表达载体的改进和优化就是其中最重要的一项内容，本文就已经取得的进展进行综述。
1 启动子的选用和改造
外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。
目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。
在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。
2 增强翻译效率
为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容：
2.1添加5‘-3‘-非翻译序列
许多实验已经发现，真核基因的5‘-3‘-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5‘-端添加了Ω翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的 3‘-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3‘-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3‘-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3‘-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3‘-端序列高60倍。
2.2 优化起始密码周边序列
虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。例如，有一个细菌的几丁质酶基因，原来的起始密码周边序列为UUUAUGG，当被修饰为ACCAUGG，其在烟草中的表达水平提高了8倍。因此，利用非植物来源的基因构建表达载体时，应根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改造。
2.3对基因编码区加以改造
如果外源基因是来自于原核生物，由于表达机制的差异，这些基因在植物体内往往表达水平很低，例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，研究发现这是由于原核基因与植物基因的差异造成了mRNA稳定性下降。美国Monsanto公司Perlak等人在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下，对杀虫蛋白基因进行了改造，选用植物偏爱的密码子，增加了GC含量，去除原序列下影响mRNA稳定的元件，结果在转基因植株中毒蛋白的表达量增加了30～100倍，获得了明显的抗虫效果。
3 消除位置效应
当外源基因被移人受体植物中之后，它在不同的转基因植株中的表达水平往往有很大差异。这主要是由于外源基因在受体植物的基因组内插入位点不同造成的。这就是所谓的"位置效应"。为了消除位置效应，使外源基因都能够整合在植物基因组的转录活跃区，在目前的表达载体构建策略中通常会考虑到核基质结合区以及定点整合技术的应用。
核基质结合区（matrix association region,MAR）是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异结合的DNA序列。一般认为，MAR序列位于转录活跃的DNA环状结构哉的边界，其功能是造成一种分割作用，使每个转录单元保持相对的独立性，免受周围染色质的影响。有关研究表明，将MAR置于目的基因的两侧，构建成包含MAR-gene-MAR结构的植物表达载体，用于遗传转化，能明显提高目的基因的表达水平，降低不同转基因植株之间目的基因表达水平的差异，减少位置效应。例如，Allen等人研究了异源MAR（来自酵母）和同源MAR（来自烟草）对Gus基因在烟草中表达的影响，发现酵母的MAR能使转基因表达水平平均提高12倍，而烟草本身的MAR能使转基因的表达水平平均提高60倍。使用来源于鸡溶菌酶基因的MAR也可起到同样作用。
另一可行的途径是采用定点整合技术，这一技术的主要原理是，当转化载体含有与寄主染色体同源的DNA片段时，外源基因可以通过同源重组定点整合于染色体的特定部位。实际操作时首先要分离染色体转录活性区域的DNA片段，然后构建植物表达载体。在微生物的遗传操作中，同源重组定点整合已成为一项常规技术，在动物中外源基因的定点整合已获得成功，而在植物中除了叶绿体表达载体可实现定点整合以外，细胞核转化中还很少有成功的报道。
4 构建叶绿体表达载体
为了克服细胞核转化中经常出现的外源基因表达效率低，位置效应及由于核基因随花粉扩散而带来的不安全性等问题，近几年出现的一种新兴的遗传转化技术--叶绿体转化，正以它的优越性和发展前景日益为人们所认识并受到重视。到目前为止，已在烟草、水稻、拟南芥、马铃薯和油菜（侯丙凯等，等发表）5种植物中相继实现了叶绿体转化，使得这一转化技术开始成为植物基因工程中新的生长点。
由于目前多种植物的叶绿体基因组全序列已被测定，这就为外源基因通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组奠定了基础，目前构建的叶绿体表达载体基本上都属于定点整合载体。构建叶绿体表达载体基本上都属于定点事例载体。构建叶绿体表达载体时，一般都在外源基因表达盒的两侧各连接一段叶绿体的DNA序列，称为同源重组片段或定位片段（Targeting fragment）。当载体被导入叶绿体后，通过这两个片段与叶绿体基因组上的相同片段发生同源重组，就可能将外源基因整合到叶绿体基因组的特定位点。在以作物改良为目的的叶绿体转化中，要求同源重组发生以后，外源基因的插入既不引起叶绿体基因原有序列丢失，又不致于破坏插入点处原有基因的功能。为满足这一要求，已有的工作都选用了相邻的两个基因作为同源重组片段，例如rbcL/accD，16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB。当同源重组发生以后，外源基因定点插入在两个相邻基因的间隔区，保证了原有基因的功能不受影响。最近，Daniel等利用烟草叶绿体基因trnA和trnI作为同源重组片段，构建了一种通用载体（universal vector）。由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度保守的，作者认为这种载体可用于多种不同植物的叶绿体转化。如果这种载体的通用性得到证实，那么这项工作无疑为构建方便而实用的新型叶绿体表达载体提供了一个好的思路。
由于叶绿体基因组的高拷贝性，定点整合进叶绿体基因组的外源基因往往会得到高效率表达，例如McBride等人首次将Bt CryIA(c)毒素基因转入烟草叶绿体，Bt毒素蛋白的表达量高达叶子总蛋白的3%～5%，而通常的核转化技术只能达到0.001%～0.6%。最近，Kota等将Bt Cry2Aa2蛋白基因转入烟草转入烟草叶绿体，也发现毒蛋白在烟草叶子中的表达量很高，占可溶性蛋白的2%～3%，比细胞核转化高出20～30倍，转基因烟草不仅能抗敏感昆虫，而且能够百分之百地杀死那些产生了高抗性的昆虫。Staub等最近报道，将人的生长激素基因转入烟草叶绿体，其表达量竟高达叶片总蛋白的7%，比细胞核转化高出300倍。这些实验充分说明，叶绿体表达载体的构建和转化，是实现外源基因高效表达的重要途径之一。
5 定位信号的应用
上述几种载体优化策略主要目的是提高外源基因的转录和翻译效率，然而，高水平表达的外源蛋白能否在植物细胞内稳定存在以及积累量的多少是植物遗传转化中需要考虑的另一重要问题。
近几年的研究发现，如果某些外源基因连接上适当的定位信号序列，使外源蛋白产生后定向运输到细胞内的特定部位，例如：叶绿体、内质网、液泡等，则可明显提高外源蛋白的稳定性和累积量。这是因为内质网等特定区域为某些外源蛋白提供了一个相对稳定的内环境，有效防止了外源蛋白的降解。例如，Wong等将拟南芥rbcS亚基的转运肽序列连接于杀虫蛋白基因之前，发现杀虫蛋白能够特异性地积累在转基因烟草的叶绿体内，外源蛋白总的积累量比对照提高了10～20倍。最近，叶梁、宋艳茹等也将rbcS亚基的转运肽序列连接于PHB合成相关基因之前，试图使基因表达产物在转基因油菜种子的质体中积累，从而提高外源蛋白含量。另外，Wandelt等和Schouten等将内质网定位序列（四肽KDEL的编码序列）与外源蛋白基因相连接，发现外源蛋白在转基因植物中的含量有了显著提高。显然，定位信号对于促进蛋白质积累有积极作用，但同一种定位信号是否适用于所有的蛋白还有待于进一步确定。
6 内含子在增强基因表达方面的应用
内含子增强基因表达的作用最初是由Callis等在转基因玉米中发现的，玉米乙醇脱氢酶基因（Adhl）的第一个内含子（intron 1）对外源基因表达有明显增强作用，该基因的其他内含子（例如intron8,intron9）也有一定的增强作用。后来，Vasil等也发现玉米的果糖合成酶基因的第一个内含子能使CAT表达水平提高10倍。水稻肌动蛋白基因的第三个内含子也能使报道基因的表达水平提高2～6倍。至今对内含子增强基因表达的机制不不清楚，但一般认为可能是内含子的存在增强了mRNA的加工效率和mRNA稳定性。Tanaka等人的多项研究表明，内含子对基因表达的增强作用主要发生在单子叶植物，在双子叶植物中不明显。
由于内含子对基因表达有增强作用，Mcelroy等在构建单子叶植物表达载体时，特意将水稻的肌动蛋白基因的第一个内含子保留在该基因启动子的下游。同样，Christensen等在构建载体时将玉米Ubiquitin基因的第一个内含子置于启动子下游，以增强外源基因在单子叶植物中的表达。然而，有研究指出，特定内含子对基因表达的促进作用取决于启动子强度、细胞类型、目的基因序列等多种因素，甚至有时会取决于内含子在载体上的位置。例如，玉米Adhl基因的内含子9置于Gus基因的5‘端，在CaMV35S启动子调控下，Gus基因的表达未见增强；当把内含子置于Gus基因3端，在同样的启动子控制下，Gus基因的表达水平却增加了大约3倍。由此可见，内含子对基因表达的作用机制可能是很复杂的，如何利用内含子构建高效植物表达载体，目前还缺乏一个固定的模式，值得进一步探讨。
7 多基因策略
迄今为止，多数的遗传转化研究都是将单一的外源基因转入受体植物。但有时由于单基因表达强度不够或作用机制单一，尚不能获得理想的转基因植物。如果把两个或两个以上的能起协同作用的基因同时转入植物，将会获得比单基因转化更为理想的结果。这一策略在培育抗病、抗虫等抗逆性转基因植物方面已得到应用。例如，根据抗虫基因的抗虫谱及作用机制的不同，可选择两个功能互补的基因进行载体构建，并通过一定方式将两个抗虫基因同时转入一个植物中去。王伟等将外源凝集素基因和蛋白酶抑制剂基因同时转入棉花，得到了含双价抗虫基因的转化植株。Barton等将Bt杀虫蛋白基因和蝎毒素基因同时转入烟草，其抗虫性和防止害虫产生抗性的能力大为提高（专利）。在抗病方面，本实验室蓝海燕等构建了包含β-1，3-葡聚糖酶基因及几丁质酶基因的双价植物表达载体，并将其导入油菜和棉花，结果表明，转基因植株均产生了明显的抗病性。最近，冯道荣、李宝健等将2～3个抗真菌病基因和hpt基因连在一个载体上，两个抗虫基因与bar基因连在另一个载体上，用基因枪将它们共同导入水稻植株中，结果表明，70%的R。代植株含有导入的全部外源基因（6～7个），且导入的多个外源基因趋向于整合在基因组的一个或两个位点。
一般常规的转化，尚不能将大于25kb的外源DNA片段导入植物细胞。而一些功能相关的基因，比如植物中的数量性状基因、抗病基因等，大多成"基因簇"的形式存在。如果将某些大于100kb的大片段DNA，如植物染色体中自然存在的基因簇或并不相连锁的一系列外源基因导入植物基因组的同一位点，那么将有可能出现由多基因控制的优良性状或产生广谱的抗虫性、抗病性等，还可以赋予受体细胞一种全新的代谢途径，产生新的生物分子。不仅如此，大片段基因群或基因簇的同步插入还可以在一定程度上克服转基因带来的位置效应，减少基因沉默等不良现象的发生。最近，美国的Hamilton和中国的刘耀光分别开发出了新一代载体系统，即具有克隆大片段DNA和借助于农杆菌介导直接将其转化植物的BIBAC和TAC。这两种载体不仅可以加速基因的图位克隆，而且对于实现多基因控制的品种改良也会有潜在的应用价值。目前，关于BIBAC和TAC载体在多基因转化方面的应用研究还刚刚开始。
8 筛选标记基因的利用和删除
筛选标记基因是指在遗传转化中能够使转化细胞（或个体）从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因。它们通常可以使转基因细胞产生对某种选择剂具有抗性的产物，从而使转基因细胞在添加这种选择的培养基上正常生长，而非转基因细胞由于缺乏抗性则表现出对此选择剂的敏感性，不能生长、发育和分化。在构建载体时，筛选标记基因连接在目的基因一旁，两者各有自己的基因调控序列（如启动子、终止子等）。目前常用的筛选标记基因主要有两大类：抗生素抗性酶基因和除草剂抗性酶基因。前者可产生对某种抗生素的抗性，后者可产生对除草剂的抗性。使用最多的抗生素抗性酶基因包括NPTII基因（产生新霉素磷酸转移酶，抗卡那霉素）、HPT基因（产生潮霉素磷酸转移酶，抗潮霉素）和Gent基因（抗庆大霉素）等。常用的抗除草剂基因包括EPSP基因（产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷）、GOX基因（产生草甘膦氧化酶、降解草甘膦）、bar基因（产生PPT乙酰转移酶，抗Bialaphos或glufosinate）等。

上面这些当中1、2、3、5、6都是值得注意的，特别是5，因为你要向细胞外分泌。骨架载体可以选择PB I121，然后你可以在上面改动基因型。

后面的就是克隆的步骤了，相对简单。
1 首先获得目的基因加酶切位点，连入改好的载体中。
2 将质粒转入大肠杆菌DH5a扩增
3 将扩增好的质粒转入植物细胞内进行表达
4 收集根细胞外培养基检测是否有该蛋白的表达和分泌。
至于改造载体那几个步骤要是答题的话简单说说就可以了，毕竟如果真的做出一个好载体都可以自己开公司了。

9. 原核生物的表达系统和真核的有什么不同

真核生物与原核生物的主要区别是：

1、真核生物具有由染色体、核仁、核液、双层核膜等构成的细胞核；原核生物无核膜、核仁，故无真正的细胞核，仅有由核酸集中组成的拟核，也称核区（生物学名词）。

2、真核生物的转录大多在细胞核中进行，也可以在半自助细胞器（如叶绿体和线粒体）中进行，蛋白质的合成在细胞质中进行，而原核生物的转录与蛋白质的合成交联在一起进行。

3、真核生物有内质网、高尔基体、溶酶体、液泡等细胞器，原核生物没有。

4、真核生物中除某些低等类群（如甲藻等）的细胞以外，染色体上都有5种或4种组蛋白与DNA结合，形成核小体 ；而在原核生物则无。

5、真核细胞在细胞周期中有专门的DNA复制期（S期）；原核细胞则没有，其DNA复制常是连续进行的。

6、真核细胞的有丝分裂是原核细胞所没有的。

7、真核细胞有发达的微管系统，其鞭毛（纤毛）、中心粒、纺锤体等都与微管有关，原核生物则否。

8、真核细胞有由肌动、肌球蛋白等构成的微纤维系统，后者与胞质环流、吞噬作用等密切相关；而原核生物却没有这种系统，因而也没有胞质环流和吞噬作用。

(9)基因原系统扩展阅读

与真核生物的种类相比，已发现的原核生物种类虽不甚多，但其生态分布却极其广泛，生理性能也极其庞杂。有的种类能在饱和的盐溶液中生活；有的却能在蒸馏水中生存；有的能在0℃下繁殖；有的却以70℃为最适温度。

有的是完全的无机化能营养菌，以二氧化碳为唯一碳源；有的却只能在活细胞内生存。在进行光合作用的原核生物中，有的放氧，有的不放氧；有的能在pH为10 以上的环境中生存，有的只能在pH为1左右的环境中生活。

有的只能在充足供应氧气的环境中生存，而另外一些细菌却对氧的毒害作用极其敏感。有的可利用无机态氮，有的却需要有机氮才能生长；还有的能利用分子态氮作为唯一的氮源等。