㈠ 如何设计引物
2.在框中粘贴入你的原始序列(要比你要扩的目的片段两端延伸一点)
3.在框的下方有许多可以设定的限制条件,如片段长度,一定包含的片段位置,引物长度,引物退火温度等,你可以进行设定
4.点击"pickup primers"就会出现下一页,上面会列出多种设计,一般来说,第一对引物是最适合的.
同时引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：
(1) 引物长度约为16-30bp,太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高.太长则比较浪费,且难以合成.
(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).
(3) 四种碱基应随机分布,在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发.
(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对.
(5) 在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构.
两引物之间尤其在3'端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量.两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性.
(7) 引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基.
引物不与模板结合位点以外的序列互补.所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量.
(9) 简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3'端应不存在简并性.否则可能由于产量低而看不见扩增产物.
㈡ 如何对含有简并碱基的序列设计引物
根据密码子的兼并性,常用一个符号代替某两个或者更多碱基。例如，编译丙氨酸的可以有4个密码子：GCU\GCC\GCA\GCG,这时生物学上为了方便，用字母N指代UCAG四个碱基，故说编译丙氨酸的密码子是GCN，其中N就是简并碱基。
通常生物学上根据蛋白质序列设计引物进行对应DNA克隆时，由于密码子的兼并性，对设计的引物上的某些碱基就会用简并碱基标示，在合成时各种碱基等量分配，也就是说，合成的简并引物是很多种引物的集合，其区别就在于简并碱基。