㈠ 如何設計引物
2.在框中粘貼入你的原始序列(要比你要擴的目的片段兩端延伸一點)
3.在框的下方有許多可以設定的限制條件,如片段長度,一定包含的片段位置,引物長度,引物退火溫度等,你可以進行設定
4.點擊"pickup primers"就會出現下一頁,上面會列出多種設計,一般來說,第一對引物是最適合的.
同時引物設計和選擇目的DNA序列區域時可遵循下列原則：
(1) 引物長度約為16-30bp,太短會降低退火溫度影響引物與模板配對,從而使非特異性增高.太長則比較浪費,且難以合成.
(2) 引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).
(3) 四種鹼基應隨機分布,在3'端不存在連續3個G或C,因這樣易導致錯誤引發.
(4) 引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應,以減少由於密碼子擺動產生的不配對.
(5) 在引物內,尤其在3'端應不存在二級結構.
兩引物之間尤其在3'端不能互補,以防出現引物二聚體,減少產量.兩引物間最好不存在4個連續鹼基的同源性或互補性.
(7) 引物5'端對擴增特異性影響不大,可在引物設計時加上限制酶位點、核糖體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等.通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護鹼基.
引物不與模板結合位點以外的序列互補.所擴增產物本身無穩定的二級結構,以免產生非特異性擴增,影響產量.
(9) 簡並引物應選用簡並程度低的密碼子,例如選用只有一種密碼子的Met,3'端應不存在簡並性.否則可能由於產量低而看不見擴增產物.
㈡ 如何對含有簡並鹼基的序列設計引物
根據密碼子的兼並性,常用一個符號代替某兩個或者更多鹼基。例如，編譯丙氨酸的可以有4個密碼子：GCU\GCC\GCA\GCG,這時生物學上為了方便，用字母N指代UCAG四個鹼基，故說編譯丙氨酸的密碼子是GCN，其中N就是簡並鹼基。
通常生物學上根據蛋白質序列設計引物進行對應DNA克隆時，由於密碼子的兼並性，對設計的引物上的某些鹼基就會用簡並鹼基標示，在合成時各種鹼基等量分配，也就是說，合成的簡並引物是很多種引物的集合，其區別就在於簡並鹼基。