宏基因組數據如何使用伺服器

『壹』 宏基因組shotgun入門筆記

目錄

根據分析對象和實驗目的，宏基因組的研究基本上可以分為

1. Pre-processing

2. Sequence analysis

包括兩種分析策略： read-based (mapping) 和 assembly-based

簡單來說，assembly-based approach 受到覆蓋度的制約，因為組裝時低覆蓋度的區域是不會進行組裝的，而是被丟棄，這樣低豐度的細菌的信息就被丟棄了，反映在reads利用率上，就是往往reads利用率極低，往往低於50%

而 read-based (mapping) approach 則受到reference databases的制約，因為細菌的遺傳多樣性很高，即便是同一個菌種，它的不同菌株，其基因組的組成也是有相對比較大的差異的，那麼在mapping的時候就會出現mapping不上的問題，使得mapping效率不夠高；而且只能分析reference databases中有的物種，對於reference databases未收錄的新物種，是無法進行分析的。

不過可用的微生物參考基因組正在迅速地增加，包括那些原先難以培養的細菌由於培養方法的改進，使得對其進行測序成為可能，再加上單細胞測序的途徑和 metagenomic assembly的途徑得到的基因組序列。現在一些類型的環境樣品（如人腸道）的參考基因組的多樣性已經可以滿足 assembly-free taxonomic profiling 的要求。

隨著測序成本的下降和測序深度的增加，其分析難度將會越來越大，制約效應也將會越來越明顯

預計的單位測序成本將會以指數關系下降,但其中計算成本下降的幅度會遠慢於測序成

在數據存儲和數據處理的層面上，rDNA和擴增序列的分析難度較小，基本可以在個人電腦或者小型伺服器上完成，但宏基因組全測序的分析卻主要受限於計算技術的發展

即使在同一個環境中獲取的不同樣本，其微生物組成也會存在比較大的差異，這使得在樣本集之間，尋找具有統計學顯著性和生物學意義的差異變得很困難。因此如何做到，在即使其影響因素的作用程度很小的情況下，也能有效地檢測出差異就顯得十分重要。

一種策略是，構造 pilot data，即將不同濃度的絕對定量 control (spike-in) 加入到樣本中，來評估實驗與分析方法的穩健性(robust)；

另一種策略：two-tiered approach，即挑取少部分樣本，既做 16s rDNA 測序，又做 shotgun metagenomics 測序，對比這兩個層次的結果來評估實驗結果的穩健性。

兩種研究策略：

由於在研究宏基因組過程中，比如研究人類的微生物群，影響其微生物群的因素眾多，包括宿主基因型，年齡，飲食習慣等等，當進行兩個環境微生物群橫向比較時，很難做到控制變數，使得在進行比較分析時混入了許多干擾因素；此時如果進行單一環境微生物群多時間點采樣的縱向比較，就可以從很大程度上消除這種影響。

1. 樣本量與測序深度

當實驗目的是檢出顯著性差異時，樣本量與測序深度的選擇取決於（1）不同樣本間微生物組組成的一致性，（2）樣本固有的微生物多樣性，（3）影響因素的效應量(effect size)

建議：參考前人在類似環境中的研究。若沒有可參照的類似研究，選擇marker gene做預實驗

2. Confounding variables and control groups

在進行宏基因組研究時，往往很難找到與目標樣本集對應的沒有其他干擾因素的對照組

建議：目前最佳的解決策略是，盡可能地搜集各個樣本群體的元數據 (metadata)，然後在隨後的比較分析中將它們考慮進去。比如臨床樣本，包括性別、年齡、是否使用抗生素/葯物、取樣位置、飲食習慣等等。比如環境樣本，包括地理位置、季節、pH、溫度等等。

元數據的搜集可以參照MIMARKS (Minimum information about a marker gene sequence) 和 MIxS (minimum information about any (x) gene sequence) 標准

3. Sample collection/preservation

樣本的處理和保存過程的差異會帶來系統偏差，比如when samples are provided from a number of locations by different research groups，或者在縱向研究中，不同取樣時間點的樣本的保存時間長短不一。有時這些處理步驟的效應量可能比你感興趣的生物學變數還大。

建議：盡可能按照相同的標准來進行取樣和保存

4. Biomass/Contamination

當前採用的基於測序的方法具有很高的靈敏度 (highly sensitive)，即使非常微量的DNA也能被檢測出來。而實驗室中使用到的常規儀器和試劑並不是無菌的，這樣就很可能在實驗操作過程中，人為地引入污染。由於檢測方法的高靈敏度，當原樣本的微生物量很少時，污染帶來的信號很可能會蓋過真實的信號。

建議：在上機測序前，做好微生物量的定量 (qPCR)。當樣品中的微生物數量少於10 5 數量級時，其極有可能會受到背景污染的干擾。此時，可以參照以下的方法進行細胞/DNA的富集：

可以增設負對照實驗 (Negative control)，對其進行與實際樣本相同的操作，使用相同的試劑，以此來找出污染的細菌類型，這樣就可以在後續的生物信息學分析過程中將其過濾掉。

5. 選擇合適的DNA提取方法

DNA提取的效果會直接對後續的實驗和分析產生巨大的影響。DNA提取方法的選擇依賴於樣品中細胞類型的組成，然而即使是相同類型的樣品其微生物組成也具有較大的差異（當人糞便中革蘭氏陰性菌主導時，細胞很容易裂解，而當由相對頑強的革蘭氏陽性菌主導時，則相反）。

因此不存在適用於所有樣品的最佳的DNA提取方案。

若方案選擇不當，則獲得的DNA主要來自於那些易裂解的細菌

建議：

Illumina測序儀通量大 (up to 1.5 Tb per run)，且准確率高 (with a typical error rate of 0.1–1%)，通過在不同樣本的序列上添加兩重barcode，可以一次測序多個samples。

然而，Illumina測序儀存在carryover (between runs) 和 carry-between (within runs)的問題。最新的測序儀由於使用了新的擴增方法 (ExAmp)，導致較高比例的『index hopping』。

雖然沒有一個明確的指導意見，告訴你在哪個特定的環境樣品中應該測多大的覆蓋度，但是一個基本的原則就是通量要盡可能地大，這樣低豐度的細菌也能被測到。Illumina HiSeq 2500/4000， NextSeq 和 NovaSeq 的測序通量都很大，都適用於 metagenomics 的研究。

Metagenome de novo assembly 採用的策略與 whole-genome assembly 相同，均為 de Bruijn 圖方法

用 de Bruijn 圖方法進行宏基因組的從頭組裝時，面臨著以下的挑戰：

當進行單一基因組的組裝時，其有一個前提假設：整個基因組的測序覆蓋度是相對均勻的，這樣就可以利用覆蓋度信息來識別重復序列和鑒定測序錯誤和等位變異。

而metagenome中，各個組成基因組的覆蓋度取決於它們的物種豐度，低豐度物種的基因組就會由於總體測序深度不夠而使得最終組裝出來的基因組是支離破碎的。使用更短的 k-mer 有助於低豐度基因組的組裝，但是這會使得圖中重復 k-mer 的頻率大大增加，降低了組裝的准確性。

這需要組裝工具在考量低豐度物種與獲得高豐度物種更長更准確的contig之間進行權衡，即選擇合適的 k-mer ：

同種細菌的不同菌株，它們的基因組組成很相近，常常就是一個鹼基的變異或者整個基因/操縱子的丟失，當進行 de Bruijn 圖組裝時，就會在這些差異的位置出現分叉，組裝工具在遇到這些分叉時，常常會停在這些位置，從而導致一個個不連續組裝片段的產生。

Meta-IDBA：將圖依據其拓撲結構拆分成各個元件，每個元件代表各個亞種的共有區域

解決計算能力與內存不足的策略：

Metagenome 組裝完成後，我們得到的是成千上萬的 contigs，我們需要知道哪些 contigs 來自哪一個基因組，或者都有哪些微生物的基因組。所以需要將 contigs 按照物種水平進行分組歸類，稱為 "bining"

一個很容易想到的策略就是，將組裝得到的片段與已知物種的參考基因組進行比對，根據同源性進行歸類。然而目前大多數的微生物的基因組還沒有測序出來，因此限制了這種方法的可行性。

目前主流的 bining 策略利用的是 contigs 的序列組成特點。

依據：來自同一菌株的序列，其核酸組成是相似的

例如根 據核酸使用頻率 （oligonucleotide frequency variations），通常是四核苷酸頻率（tetranucleotide frequency）， GC含量 和 必需的單拷貝基因 等

優勢：即便只有一個樣品的宏基因組數據也可以進行binning，這在原理上是可操作的

不足：由於很多微生物種內各基因型之間的基因組相似性很高，想利用1個樣品的宏基因組數據通過核酸組成信息進行binning，效果往往並不理想或難度很大。利用核酸組成信息進行binning，基本上只適合那些群落中物種基因型有明顯核酸組成差異的，例如低GC含量和一致的寡核苷酸使用頻率

依據：來自同一個菌株的基因在不同的樣品中 ( 不同時間或不同病理程度 ) 的豐度分布模式是相似的【PMID: 24997787】。

原因：比如，某一細菌中有兩個基因，A和B，它們在該細菌基因組中的拷貝數比例為 A:B = 2:1，則不管在哪個樣品中這種細菌的數量有多少，這兩個基因的豐度比例總是為 2:1

優勢：這種方法更有普適性，一般效果也比較好，能達到菌株的水平

不足：必須要大樣本量，一般至少要50個樣本以上，至少要有2個組能呈現豐度變化 ( 即不同的處理，不同的時間，疾病和健康，或者不同的采樣地點等 ) ，每個組內的生物學重復也要盡量的多

對於像質粒這樣的可移動遺傳單元 (mobile genetic elements (MGEs))，由於其復制獨立於細菌染色體，則同一種細菌的不同個體，該質粒的拷貝數可能存在差異，使得無法用豐度信息進行有效地bining

將核酸組成信息和豐度差異信息創建一個綜合的距離矩陣，既能保證binning效果，也能相對節約計算資源，現在比較主流的binning軟體多是同時依據核酸組成和豐度變化信息

依據：不同的細菌，其基因組甲基化模式不同，平均一種細菌有3種特意的甲基化 motif。MGEs (mobile genetic elements) 中含有 MTase 基因，其基因水平轉移是細菌甲基化組多樣性的驅動因素。雖然 MGEs 在不同個體的拷貝數不同，但是都存在，因此具有相同 MGEs 的細菌個體，其總遺傳物質（包括染色體和 MGEs ）都會受到相同的MTase的作用而得到相同的甲基化模式。

Q1：從哪些序列下手進行binning呢？

從原始的clean reads，還是從組裝成的contig，還是從預測到的gene，都可以。根據基於聚類的序列類型的不同，暫且分為reads binning， contig binning和 genes binning

比較這三種binning的優劣：

總體來說應用最廣泛的就是基於genes binning 和 contig binning

Genes binning的一般流程

在宏基因組做完組裝和基因預測之後，把所有樣品中預測到的基因混合在一起，去冗餘得到unique genes集合，對這個unique genes集合進行binning，主要是根據gene在各個樣品中的豐度變化模式，計算gene之間的相關性，利用這種相關性進行聚類

該圖中的聚類過程類似於 K-means聚類 ：隨機選擇幾個seed genes作為誘餌，計算其他基因豐度分布模式與seed genes的相關性，按照固定的相關性值PCC>0.9，將它們歸屬於不同seed genes所代表的類，然後在聚好的類內重新選擇seed genes，進行迭代，最終聚類得到一個個基因集合，較大的集合（超過700個基因）稱為 metagenomic species (MGS)，較小的集合稱為 co-abundance gene group (CAG)

基於 bining 結果進行單菌組裝：

比如對核酸組成信息的利用，開發得就不夠充分，四鹼基使用頻率因簡單而被廣泛使用和接受，但現在已有研究表明k-mer豐度信息也是很好的種系特徵，同時越長的k-mer含有越多的信息，還有基因和參考基因組間的同源關系也是有價值的種系信號，但這些都還沒有被自動化的binning軟體整合

想要獲得高質量的bins經常需要手動調整

Taxonomic profiling: identifies which microbial species are present in a metagenome and estimates their abundance

優點：

當然它也有局限性：

對於與人類密切相關的樣品，比如人腸道，可以使用該策略，而且已經有相關的成功實踐

By looking at co-abundant markers from preassembled environment-specific gene catalogs

即前人研究 (MetaHIT consortium) 已經得出特定環境下的微生物的組成，這些微生物中有某些 co-abundant markers（這些 marker genes 的豐度與其物種的豐度成正比），這樣就可以基於對這些 markers 的定量得到對應的物種豐度

選擇 markers 的不同策略：

當樣本量巨大，都進行組裝是明顯不切實際的，此時採用 marker-based approaches 是一個不錯的選擇；而且，如果該環境來源的樣本其組成微生物是研究比較充分時，marker-based approaches 能得到比較准確的物種定量結果。

Gene identification

Characterization of the functional potential of the microbiome

局限性 ： lack of annotations for accessory genes in most microbial species

因為在評估微生物群體的代謝潛能時，只對那些高度保守和 housekeeping 類型的功能進行了注釋，這就解釋了，為什麼來自不同環境的不同樣品，它們的功能特徵常常是十分相似的，即使它們的物種組成有很大差異。

例如，鑒定出微生物群落中的抗生素抗性基因，該方法高度依賴特定功能相關基因集注釋的質量。

參考資料：

(1) 魏子艷, 金德才, 鄧曄. 環境微生物宏基因組學研究中的生物信息學方法[J]. 微生物學通報, 2015, 42(5):890-901.

(2) Quince C, Walker A W, Simpson J T, et al. Shotgun metagenomics, from sampling to analysis[J]. Nature Biotechnology, 2017, 35(9):833.

(3) 句句干貨！一文讀懂宏基因組binning

(4) Nielsen H B, Almeida M, Juncker A S, et al. Identification and assembly of genomes and genetic elements in complex metagenomic samples without using reference genomes[J]. Nature Biotechnology, 2014, 32(8):822-828.

(5) Sangwan N, Xia F, Gilbert J A. Recovering complete and draft population genomes from metagenome datasets[J]. Microbiome, 2016, 4(1):8.

(6) Abubucker, S. et al. Metabolic reconstruction for metagenomic data and its application to the human microbiome. PLoS Comput. Biol. 8, e1002358(2012).

(7) Beaulaurier J, Zhu S, Deikus G, et al. Metagenomic binning and association of plasmids with bacterial host genomes using DNA methylation.[J]. Nature Biotechnology, 2017, 36(1).

『貳』 如何用宏基因組測序

宏基因組學這一概念最早是在1998年由威斯康辛大學植物病理學部門的JoHandelsman等提出的，是源於將來自環境中基因集可以在某種程度上當成一個單個基因組研究分析的想法，而宏的英文是「meta-」，具有更高層組織結構和動態變化的含義。後來伯克利分校的研究人員KevinChen和LiorPachter將宏基因組定義為「應用現代基因組學的技術直接研究自然狀態下的微生物的有機群落，而不需要在實驗室中分離單一的菌株」的科學。

『叄』 宏基因組學研究—宏基因組數據的假設檢驗

1. 宏基因組數據假設檢驗介紹

1.1 假設檢驗在科研中的應用

隨著人類微生物研究從技術發展和基礎科學發現向轉化醫學和環境研究的轉變，統計假設檢驗的應用將變得越來越重要。

假設檢驗：一種統計過程，用以確定所收集的數據是否提供了足夠的證據來接受一個無效的假設。

1.2 多少樣本才能達到特定效能水平支持組別的差異

明確四個問題： 

1）生成數據的分布是什麼？ 

2）效應值（Effectsize）有多大？  

3）什麼樣的檢驗統計量將被用來拒絕或不拒絕無效假設？  

4）需要怎樣的統計學性能水平？P<0.0580%檢驗功效；P<0.0190%檢驗功效。

1.3  P值、檢驗功效、效應值和樣本量是相關的

如果P值和檢驗功效保持不變，則較大（較小）的效應值會導致較小（較大）的樣本量。

假設P值和效應值大小保持不變，增大（減小）樣本量將增大（減小）研究的檢驗功效。  

這說明了為什麼在設計一個實驗時必須指定這四個參數（P值、檢驗功效、效應值和樣本量）。

2.宏基因組數據及假設檢驗分析

2.1 數據結構展示

數據結構展示示意圖

數據的標准化或規范化問題：轉換數據應該基於堅實的理論基礎和特定的目的。

2.2 在不同分組中比較感興趣的分類單元

問題：不同組間推斷某一分類單元特殊性。  

重要的是分類單元不是研究人員通過查看數據得知哪些分類單元最不一樣，而是應用檢驗來證明他們所觀測到的不同是真實的。  

當想要比較不同類群的物種豐富度時，將數據標准化到一個共同的尺度是很重要的。（比如：百分比-如果很大一部分百分比介於0–20%和80–100%之間，則可能會出現問題，在這種情況下，應考慮使用逆正弦變換來穩定方差;對計數數據進行更復雜的建模，如負二項回歸，也可以考慮看看分類單元計數是否受受試者表型[如年齡、性別和健康狀況]）的影響）

問題：比較分類單元是否以不同的速率存在於不同的組別中。  

如果該分類單元缺失—0；如果該分類單元存在—1；常使用卡方檢驗。

如果預實驗結果理想，正式實驗時想確保檢驗功效的情況下，可以通過如下計算獲取樣本量信息。 

計算檢驗功效，首先需要評估效應值，效應值相當於平均值的差異。分類數據則需要其他度量方式（比如：Cramer』sPhi、oddsratio、relativerisk）。

樣本量

多重檢驗的問題：在不同的組別中，分別獨立比較每個分類單元時發生。  

P值含義：如果在檢驗情況下，零假設是真的（即，分類單元在組間的分布是相同的），P值告訴我們在數據中，觀察到的組間差異發生的概率完全是由於偶然性。當我們接受P≤0.05的同時也就同樣明確地接受，有5%的偶然性表示無差異組別存在差異性（即，被稱為I類錯誤，當零假設為真時拒絕零假設，或假陽性）。

2.3  比較所有組別中分類單元頻數分布

雖然可以通過每個分類單元的豐度，對多個組別的分類單元進行調整，完成多重比較。但該方法通常不如多變數分析方法有力，因為它沒有考慮類群之間存在的相互作用。多元統計方法正是針對這類問題而發明的。  

分類單元數量的Dirichlet-Multinomial(DM) model是一種應用於宏基因組數據的多重分布方法。  

與非參數方法相比，參數模型改進了數據分析，並且通常簡化了P值、樣本量、功效、誤差度量和置信區間的計算。往往通過參數自然度量效應值。

對數據使用錯誤的統計模型往往會導致錯誤的結果，因此，在設計研究時必須留意。對宏基因組計數數據的第一步，自然觀察可能會導致統計學家考慮使用多項式模型進行假設檢驗，以及功效和樣本量的計算。  

多項式模型是不正確的，因為它不能捕捉到宏基因組數據中存在的過度變異性（即，過度分散）。 

使用錯誤的分布模型將導致在判斷組別是否存在差異時，顯著增加差異組別的非差異性（II類型錯誤或假陰性）。

2.4  注意事項

使用多重檢驗並使用幾種不同的多重檢驗來調整P值。這種分析方法的優點：允許針對單個類群進行檢驗，以了解它們如何影響表觀現象。缺點：是忽略了類群之間的相互作用或相關性，並將它們視為獨立的，這在分析宏基因組數據未必合適。  

基於置換檢驗的PERMANOVA和ANOSIM等其他方法也經常被使用，並且可以使用統計學工具來定義效應值、效能計算和樣本量。對於喜歡使用非參數方法的研究者來說，有大量的文獻來指導和使用。

『肆』 宏基因組測序流程

問題一：如何用宏基因組測序？ 10分 宏基因組即生境中全部微小生物遺傳物質的總和。它以環境樣品中的微生物群體基因組為研究對象, 以功能基因篩選和測序分析為研究手段, 以微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作關系及與環境之間的關系為研究目的。宏基因組學技術第一次使人類得以研究占環境中99%的不可培養的微生物種群，從而成為微生物研究的最前沿領域
對環境樣本進行DNA提取後進行16S或18S等區域擴增，再對擴增產物進行建庫、測序，然後對所得的數據進行生物信息學分析。生物信息分析主要包括OTU的生成及rank-abundance分析、取樣充足性分析、豐度和多樣性分析、菌群間差異分析、假設驗證分析、進化樹分析等。

問題二：宏基因組測序需要dna濃度多少 宏基因組是指特定環境中全部生物（微生物）遺傳物質的總和。宏基因組測序是利用高通量測序技術對環境樣品中全部微生物的基因組進行測定，以獲得單個樣品的飽和數據量，可進行微生物群體的基因組成及功能注釋，微生物群體的物種分類，多樣性分析，群落結構分析，樣品間的物種或基因差異以及物種間的代謝網路研究，探索微生物與環境及宿主之間的關系，發掘和研究新的具有特定功能的基因等。與傳統方法相比，基於高通量測序的宏基因組研究無需構建克隆文庫，這避免了文庫構建過程中利用宿主菌對樣品進行克隆而引起的系統偏差，簡化了實驗操作，提高了測序效率。此外，宏基因組測序研究擺脫了微生物分離純培養的限制，擴展了微生物資源的利用空間，為環境微生物群落的研究提供了有效工具。通過宏基因組深度測序可以揭示或估計環境中真實的物種多樣性和遺傳多樣性，挖掘具有應用價值的基因資源，應用於開發新的微生物活性物質，為研究和開發新的微生物活性物質提供有力支持。
技術流程
生物信息分析
1. 原始數據整理、過濾及質量評估
2. 基於物種豐度分析：
?物種豐度列表
?稀釋曲線
3. 基於物種豐度分析：
?豐度分布曲線圖
?生物多樣性指數（α多樣性）列表
?物種豐度差異性分析列表
?多樣品物種分布柱圖
?豐度差異物種聚類分析
?PCA圖
?Krona圖
4. 基因豐度列表：
?提取基因分級注釋豐度列表（KO、NOG、subsystem）
?功能基因列表
?生成venn圖
?基因豐度差異性分析列表
?豐度差異基因聚類分析
?富集分析（KO）
樣品要求
1、樣品採集：樣品採集條件的一致是最為重要的環節，嚴格按照采樣標准采樣，采樣後立即封存樣品冷凍保存。
2、樣品DNA：環境因素異常復雜，許多物質或抑制因子影響後續PCR、測序文庫構建和序列測定，常規提取方法不一定適合，建議採用專用試劑盒提取。DNA濃度≥20 ng/μl，總量≥6 μg（熒光定量），並確保電泳檢測無明顯RNA條帶，基因組條帶清晰、完整；基因組DNA完全無降解；提供DNA電泳檢測照片，用自封袋密封後隨樣品一起送樣；組織樣品1.5 g。
3、樣品保存期間切忌反復凍融。
4、送樣管務必標清樣品編號，管口使用Parafilm膜密封。

問題三：如何用宏基因組測序 宏基因組學這一概念最早是在1998年由威斯康辛大學植物病理學部門的JoHandel *** an等提出的，是源於將來自環境中基因集可以在某種程度上當成一個單個基因組研究分析的想法，而宏的英文是「meta-」，具有更高層組織結構和動態變化的含義。後來伯克利分校的研究人員KevinChen和LiorPachter將宏基因組定義為「應用現代基因組學的技術直接研究自然狀態下的微生物的有機群落，而不需要在實驗室中分離單一的菌株」的科學。

問題四：宏基因組測序都能得到那些結果？可以用於什麼研究？ 宏基因組測序，是對特定環境（或者特定生境）樣品中的微生物群體基因組進行序列的測定，以分析微生物群體基因組成及功能，解讀微生物群體的多樣性與豐度，探求微生物與環境，微生物與宿主之間的關系，發掘和研究新的、具有特定功能的基因。宏基因組測序研究避開了微生物分離培養的過程，擴展了微生物資源的利用空間，為研究微生物相互作用提供了有效工具。閱微基因採用第二代高通量測序技術進行宏基因組學研究，無需構建克隆文庫，可以直接對環境樣品中的基因組片段進行測序，這避免了文庫構建過程中利用宿主菌對樣品進行克隆而引起的系統偏差，簡化了宏基因組研究的基本操作，提高了測序效率，從而極大地促進了宏基因組學的發展。通過大量測序，可以獲得樣品的群落結構信息，如微生物物種在該環境下的分布情況及成員間協作關系等，通過還可以確定一些特殊的主要基於或者DNA片段。對於多個樣品，還可做相應的比較分析，發掘樣品間的相同點與不同點。
宏基因組測序，可以用於疾病研究，微生物種群分析，環境多樣性分析，遺傳多樣性分析，只要有微生物的地方，就可以用到宏基因組測序

問題五：請問有誰做過微生物宏基因組測序，公司反饋回來的數據都包含哪些，通常一個樣得多少錢？ 數據內容：
1，原始的fastq文件。
2，數據分析報告：1，數據的質控 2，序列的拼接及拼接效果評估 3，對拼接contig序列的注釋
4，基因的豐度分析，門綱科目屬種的豐度分析 5，樣本之間差異gene的分析
6，差異基因的功能分析（GO，pathway等） 7，樣本間差異顯著的物種分析
8，如果樣本比較多可以組微生物類群結構分析。
價格方面可以私信我留個郵箱，我可以發你一些資料和價格。

問題六：宏基因組分析和16srna的區別 功能基因芯和宏基因組測序的區別
基因組，Genome，一般的定義是單倍體細胞中的全套染色體為一個基因組，或是單倍體細胞中的全部基因為一個基因組。可是基因組測序的結果發現基因編碼序列只佔整個基因組序列的很小一部分。因此，基因組應該指單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內的全部DNA分子。說的更確切些，核基因組是單倍體細胞核內的全部 DNA分子；線粒體基因組則是一個線粒體所包含的全部DNA分子；葉綠體基因組則是一個葉綠體所包含的全部DNA分子
轉錄組（transcriptome）廣義上指某一生理條件下，細胞內所有轉錄產物的 *** ，包括信使RNA、核糖體RNA、轉運RNA及非編碼RNA；狹義上指所有mRNA的 *** 。
從定義上看，很明顯，基因組一般指的是DNA（某些只含有RNA的生物除外），而轉錄組則指的是RNA。

『伍』 宏基因組學的應用

採用宏基因組技術及基因組測序等手段，來發現難培養或不可培養微生物中的天然產物以及處於「沉默」狀態的天然產物。宏基因組不依賴於微生物的分離與培養，因而減少了由此帶來的瓶頸問題。
隨著新一代測序技術的迅猛發展，研究宏基因組的方法也已經發生了翻天覆地的變化：傳統的方法是測定微生物基因組上的16S rRNA基因，這些基因的長度通常在1500個鹼基左右，廣泛分布於原核生物，既能提供足夠的信息，而且具有相對緩慢的進化過程；其保守性與特異性並存，通過保守區和特異區來區別微生物的種屬。基於這些特性，科學家們通過選擇這些基因區域，方便地研究環境中物種的組成多樣性，但是還不能全面分析環境中的基因功能。而現在，新一代高通量低成本測序技術的廣泛應用，科學家們可以對環境中的全基因組進行測序，在獲得海量的數據後，全面地分析微生物群落結構以及基因功能組成等。
短短幾年來，宏基因組學的研究已經滲透到各個領域，從海洋到陸地，再到空氣，從白蟻到小鼠，再到人體，從發酵工藝到生物能源，再到環境治理等。

『陸』 如何有效地對病毒宏基因組測序的數據進行分析

得出數據之後。
用dps 或者excel載入宏都可以進行分析
你們統計學的上機操作應該學過，再翻翻
那本教材