⑴ 轉錄組分析--差異分析DeSeq
1 ###數據讀入和處理
2 #### dds矩陣的創建 ####
3 ### DESeq2進行差異分析 #####
4 #### DESeq2分析中得到的resdata進行繪制火山圖 #####
5 篩選差異基因
6 表達矩陣探索,選取差異表達的基因做熱圖 (注意是用矯正後p值排外序的)
7 PCA分析 使用對dds矩陣處理後的vst或rld值
⑵ 珍藏 史上最全熱圖繪制工具及操作流程（一）
heat map（熱圖）一詞相信大家肯定不會陌生，在很多重量級科學論文中非常常見。使用heat map可以容易展示多組分之間關系或相關性，也能展示基因表達前後差異。heat map其實還蘊含不少分析的秘訣，這么高大上的heat map是怎樣實現的呢？
熱圖的應用性很廣，在介紹熱圖繪制工具之前，我先給大家科普科普，講講有關熱圖的基本概念、歷史、用途。
Heat map 的基本概念
Heatmap是熱圖，也叫熱力圖，可以用顏色變化來反映二維矩陣或表格中的數據信息，可以直觀地將數據值的大小以定義的顏色深淺表示出來。熱圖使復雜的數據可視化和一目瞭然。通常根據需要將數據進行物種或樣品間豐度相似性聚類，將聚類後數據表示在熱圖上，可將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度來反映多個樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。結果可有彩虹色和黑紅色兩種選擇。
熱圖有兩類：集群熱圖（cluster heat map）和空間熱圖（spatial heat map）。在集群熱圖里，圖片大小固定在單元格里，制定成一個包含行和列的矩陣。單元格大小是可任意調節。而在空間熱圖里，在一個空間里大小和位置都固定好的。
Heatmap的生成原理可以這樣概括，先為離散點設定一個半徑，創建一個緩沖區；再對每個離散點的緩沖區，使用漸進的灰度帶（完整的灰度帶是0-255），從內至外、從淺至深填充；因為灰度值可以疊加，數值越大則顏色越深，在灰度帶中顯得越白。實際上可選擇ARGB模型中任一通道作為疊加灰度值，從而對於有緩沖區交叉的區域，可疊加灰度值，因而緩沖區交叉的越多，灰度值越大，這塊區域越「熱」。最後，用疊加後的灰度值為索引，從一條有256色的色帶中映射顏色，並對顏色重新著色，從而實現熱圖。
灰度帶
彩色帶
熱圖的歷史
熱圖其實並不是一種新的概念，可以追溯到19世紀。
熱圖起源於數據矩陣中二維數值的顯示。較大的數值用較小的深灰色或黑色方塊（像素）表示。在1873年Lona就使用了陰影矩陣將巴黎各區的社會上統計數據實現了可視化。在1957年Sneath展示了聚類分析的結果，通過對矩陣的行和列進行置換，根據聚類將相似數值放置在彼此的附近。之後Jacques Bertin使用了類似方法顯示出符合格特曼尺度的數據，他將集群樹連接到數據矩陣的行和列，這一想法來自於1973年Robert Ling。Robert Ling使用了列印機的字元來表示不同灰度，即一個像素就有一個字元寬度。在1994年Leland Wilkinson開發了第一個計算機程序（SYSTAT），用於製作高解析度彩色圖形的集群熱圖。在1991年，軟體設計師Cormac Kinney注冊了「heatmap」商標，發明了一種用2D圖形顯示實時金融市場信息的工具。如今，熱圖仍然可以手工形式、Excel電子表格或使用像Hotjar這樣的專業軟體創建。
熱圖的4種類型
第一種，生物學熱圖，通常用在分子生物學范疇，可以顯示從DNA微陣列獲得的大量可比較樣本（不同狀態下的細胞、不同患者的樣本）中的很多基因的表達水平。
第二種，樹形圖，是數據的2D分層分區，在視覺上類似於熱圖。
第三種，馬賽克圖，是一種平鋪熱圖，用於表示雙向或更高方式的數據表，與樹形圖一樣，鑲嵌在圖中的矩形區域是分層組成。意味著這些區域是矩形。
第四種，密度函數可視化圖，用來表示出圖中點密度的熱圖，使人們能夠獨立在變焦參數感知點的密度。在2015年Perrot等人提出的一種方法，通過使用Spark和Hadoop等大數據基礎設備，利用密度函數可看到幾十億個點。
熱圖在各個領域內的用途
熱圖通過眾多數據點信息，匯聚成直觀可視化顏色效果，至今熱圖被廣泛應用在不同領域和范疇，比如氣象預報、醫療成像、機房溫度等，甚至應用於競技體育領域的數據分析。
觀看一場世界盃足球競賽時，評委們通常利用熱圖了解到champion隊伍中門將、後衛、中場和前鋒的跑位，讓我們一目瞭然地看到多名球員在比賽中跑位的差異。
氣象局還可利用熱圖判斷地震震源位置，可清楚看出哪些地方是地震高發區（頻率最高）。
還可結合網路地圖和熱圖，就可利用熱圖看到金融商圈，將商家的坐標採集下來，根據坐標點進行聚類。看下面這張圖，紅色表示商家較多的地方，我們就可知道哪些是金融商圈。
那麼，在 生物學 領域上熱圖提供什麼用處呢？
熱圖經常用於 展示多個基因在不同樣本的表達水平 ，然後通過聚類等方式查看實驗組和對照組特有的方式。
如上圖所示，每一列代表一個樣本，每一行代表一個基因，顏色代表表達量（這張圖的圖例看出，顏色越偏紅色，數值越大，基因表達量越高）。
熱圖還可用於 展示其他物質的豐度 ，如某細菌的相對豐度、代謝組不同物質的含量。當然熱圖還有一個重要的用處是展現出不同指標、不同樣本等之間的相關性。
以上這圖就是相關性熱圖，顏色深淺代表著相關系數的大小，越接近白色說明相關性越弱，偏藍（負相關）或偏紅（正相關），顏色越淺說明相關性越弱。在相關性計算中除了相關系數外，我們還看到p值是否顯著。如果把P值表示出來，可以在方格內加入*號或具體數值。但是由於我們在上圖看到不同的兩個指標之間的關系是被重復展現2次，所以有時候我們只需展現一半（對角線以上或以下）的一半圖形就夠了。就像下圖所示：
好了，這篇就講到這里，下一篇將為你揭曉更多有關熱圖的奧秘。
⑶ 初學者R語言：熱圖基礎畫法及個性化調整詳解
熱圖（Heatmap）：用顏色變化直觀的表達數據之間差異的圖，是對實驗數據進行質制和差異數據的展現，是數據挖掘類文章的標配。
例如上圖，每個小方格表示每個基因，其顏色表示該基因表達量大小，表達量越大顏色越深（紅色為上調，藍色為下調）。每行表示每個基因在不同樣本中的表達量情況，每列表示每個樣品中所有基因的表達量情況。上方樹形圖表示對來自不同實驗分組的不同樣品的聚類分析結果
⑷ 如何利用pheatmap包繪制基因表達熱圖
1. 輸入demo數據到R中
利用read.delim()函數讀取demo.txt文件，將文件中的基因表達數據存到名為data的對象中。
利用str()函數查看data對象，存儲有100個觀測值(obs，即100個基因轉錄本)，每個觀測值對應20個變數（即在20個樣本中的表達值水
平），數據類型為數值型（num）。已知其中sample1~sample10來自A組，sample11~sample20則來自B組。
2. 利用pheatmap包中的pheatmap()函數繪制熱圖
鍵入代碼，按默認方式進行熱圖繪制
簡單一句代碼，熱圖便繪制完成
⑸ 熱圖展示單細胞轉錄組基因在不同組中表達陽性細胞差異
近日，看到-生信作曲家-發的帖子，展示的內容是單細胞差異基因的圖，是利用熱圖的形式展現的，在一個熱圖上可以展示不同cluster中不同組的基因表達陽性細胞比例，差別一目瞭然，可以同時展示很多的基因。
首先構建作圖數據，我們用最「笨」的辦法吧，分別找出不同細胞類型下，兩組之間（GM， BM）的差異基因，這里設置閾值為0，讓所有基因都保留下來。然後設置需要查看或者展示的基因，分別在各個差異基因文件中提取這些基因的表達數據，我們需要的數據是ptc1和ptc2這兩列，分別對應兩個分組。最後將所有細胞差異基因中提取的數據進行合並就可以作圖。
熱圖的做法很簡單，參考我們之前的系列：
畫熱圖只標注感興趣的基因名稱
熱圖2：分組聚類，讓熱圖分裂
熱圖3：熱圖行列分組信息注釋
熱圖4：ComplexHeatmap畫復雜熱圖行列注釋
我們可以直接用pheatmap來畫，但是區別在於需要將每個基因在細胞中的表達數值顯示在熱圖上，只需要加display_numbers = TRUE參數即可。
最後導出pdf圖片，用AI修飾一下即可。
當然ComplexHeatmap包的Heatmap函數也是適用的。如果需要進行更多的修飾和改造也是可以的。（ 補充：之前的熱圖系列沒有說到一個問題就是ComplexHeatmap做熱圖之後的legend標題的問題，自動顯示的是matrix，而且每畫一次，就在後面加數字，有很多小夥伴有這個疑問。其實在他的參數heatmap_legend_param 中是可以定義標題和legend位置的。 ）
最後修飾修飾成為一個可發表的圖片。
這個熱圖還是挺實用的，有需要示例數據的小夥伴可在我的公眾號《KS科研分享與服務》----聯系作者索取數據，記得在公眾號後台留下您的郵箱！
⑹ 案例演示 | R語言繪制熱圖代碼
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我們在分析了差異表達數據之後，經常要進行熱圖的可視化展示。
熱圖（Heat map） 是一個以 顏色 變化來顯示數據的 矩陣 。雖然「熱圖」是一個新興的詞彙，但是用明暗的矩陣來標示元素的方法已經有超過一世紀的歷史了。
熱圖源自於展示數據的平面圖像，較大的數字以小的深灰色、黑色方格呈現，而較小的數字則以較亮的方格標示。如Toussaint Loua在1873年就曾使用這樣的手法來繪制對 巴黎 各區的社會學統計。 [1] 彼得·斯伊斯在1957年時進行 群集分析 時也透過置換矩陣的行和列的方法將更相似的值標示在一起。雅克·貝爾坦也曾用過類似的方法標示出 累積量表 的資料。而將 階層式分群法 加入到矩陣中的概念則是由羅伯特·F·林於1973年創造，他利用多次印刷堆疊出的字元來表示不同程度的灰色，將每個字元大小則視為一像素。利蘭·威爾金森則是於1994年開發出了第一個能生成高解析度的矩陣的計算機程序—SYSTAT。
軟體設計師科爾馬克·金尼則在1991年時注冊了熱圖這個商標用以形容一種描繪金融市場信息的平面圖形， [2] 但是取得了金尼發明的公司在2003年時不小心使得這個商標失效了 [3]
⑺ Read count CPM RPKM
RNA-seq看錶達量高低是看哪個值？
1.Read count
(1)數值概念： 比對到gene A的reads數。
(2)用途： 用於換算CPM、RPKM等後續其他指標；作為基因表達差異分析的輸入數值。
大部分 差異分析軟體（如DESeq和edgeR） ，用原始的可比對的reads count作為輸入，並用 負二項分布模型估算樣本間基因差異表達的概率 。
軟體自動會對reads count做一些校正。如果你使用一些校正後的指標，例如RPKM作為輸入，是不合理的。
2.CPM：Counts per million
(1)數值概念： 計算公式：CPM=C/N*1000000
設C為比對到 gene A 的 reads 數（read count），
N 為比對到所有 gene 的總reads 數。
(2)用途： 在某些情況下,只想了解每個基因被覆蓋到的相對reads數，而不希望對其做長度校正，就會使用這個指標。
在某些RNA-seq文章或一些軟體輸出結果中（如edgeR）會出現。
CPM只對read count相對總reads數做了數量的均一化。
當如果想進行表達量的基因間比較，則不得不考慮基因長度的不同。
如果進一步做長度的均一化，就得到了下面的RPKM。
3.RPKM：Reads Per kb perMillion reads
(1)數值概念： 計算公式：RPKM=(1000000 C)/(N L/1000)
設C 為比對到 gene A 的 reads數（read count），
N為比對到所有 gene 的總 reads 數，L 為 gene A 的鹼基數。 RPKM法能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響，
計算得到的基因表達量可直接用於比較不同樣品間的基因表達差異。
(2)用途： 用於與基因表達量相關的後期分析.例如:基因表達趨勢分析,共表達網路構建，熱圖繪制等都使用這類數值。
FPKM意義與RPKM極為相近。
二者區別僅在於，Fragment 與Read。
RPKM的誕生是針對早期的SE測序，FPKM則是在PE測序上對RPKM的校正。
只要明確Reads和Fragments的區別，RPKM和FPKM的概念便易於區分。
Reads即是指下機後fastq數據中的每一條Reads，
Fragments則是指每一段用於測序的核酸片段。
1.RNA-Seq 又稱轉錄組高通量測序(transcriptome sequencing)或稱為全轉錄組鳥槍法測序(Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS)
把高通量測序技術應用到由 RNA 逆轉錄生成的 cDNA 上，
從而獲得來自不同基因的RNA 片段在特定樣本中的含量
2.基因表達（gene expression）
基因組中結構基因經過轉錄、翻譯等過程，合成蛋白質，
進而發揮其特定的生物學功能的全過程。
3. 轉錄組
遺傳學中心法則表明,遺傳信息通過信使RNA(mRNA)從DNA傳遞到蛋白質,
因此,mRNA被稱為DNA和蛋白質之間信息傳遞的」橋梁」,
而所有表達基因的序列及其轉錄水平,綜合起來被稱為 轉錄組(transcriptome)。
即:特定組織或細胞在某一功能狀態下所能轉錄出來的所有RNA的總和，
包括mRNA和非編碼RNA。
轉錄組（transcriptome）
廣義上 指某一生理條件下，細胞內所有轉錄產物的集合，
包括 信使 mRNA、 核糖體 rRNA、 轉運 tRNA及 非編碼 non-coding RNA；
狹義上 指所有mRNA的集合。
蛋白質是行使細胞功能的 主要承擔者 ，蛋白質組是細胞功能和狀態的 最直接描述 ，
轉錄組成為研究基因表達的主要手段，
轉錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質組的必然紐帶，
轉錄水平的調控是目前研究最多的，也是生物體最重要的調控方式。
基因的Transcript Variant 和 isoform的區別如下：
1.transcript variant是從結果來看的，一個基因產生了不同的mRNA；
splice variant是從過程講的，強調 內含子 剪切的方式不一樣。
variant指的是轉錄本的亞型，
isform指的是蛋白水平的。
有的時候雖然variant很多但是對應的蛋白可能是重復的。
2.有很多過程可以影響isoform的形成，如 可變剪切 ，
即不一定所有的 外顯子 都用來形成成熟的mRNA,而且有時候什麼 內含子 , 外顯子 也不是絕對的。
另外有 RNA editing 這個過程，會使得形成mRNA時某個特定的位置的鹼基發生變化，
也就是變成不是原來基因想要編碼的東西。
有個例子就是一個叫XBP-1的 轉錄因子 ，它調控細胞的unfolded protein response，
激活方式就是上游蛋白剪切其mRNA然後生成有活性的mRNA，
所以這種variant的生成竟然也是調控的一種方法。
⑻ 基因差異表達的熱圖是什麼軟體分析的
我不是很熟悉，簡單說兩句拋磚引玉一下。 1。左側的文本應該是基因編號，熱圖的每一行代表一個基因（或mRNA?）。 2。下方的文本應該是樣本編號，熱圖的每一列代表一個樣本。 3。上方的樹狀結構代表樣本之間的相似度聚落關系。比如從左往右，一，...
⑼ 熱圖繪制
公眾號鏈接: http://mp.weixin.qq.com/s/mNSkf1rjWTCtE1pIOuI2rA
熱圖是做分析時常用的展示方式，簡單、直觀、清晰。可以用來顯示基因在不同樣品中表達的高低、表觀修飾水平的高低等。任何一個數值矩陣都可以通過合適的方式用熱圖展示。
本篇使用R的 ggplot2 包實現從原始數據讀入到熱圖輸出的過程，並在教程結束後提供一份封裝好的命令行繪圖工具，只需要提供矩陣，即可一鍵繪圖。
上一篇講述了Rstudio的使用作為R寫作和編譯環境的入門，後面的命令都可以拷貝到Rstudio中運行，或寫成一個R腳本，使用 Rscript heatmap.r 運行。我們還提供了Bash的封裝，在不修改R腳本的情況下，改變參數繪制出不同的圖形。
繪圖首先需要數據。通過生成一堆的向量，轉換為矩陣，得到想要的數據。
注意：運算符的優先順序。
Vector轉為矩陣 (matrix)，再轉為數據框 (data.frame)。
雖然方法比較繁瑣，但一個數值矩陣已經獲得了。
還有另外2種獲取數值矩陣的方式。
可以看到列名字中以數字開頭的列都加了 X 。一般要盡量避免行或列名字以 數字開頭 ，會給後續分析帶去一些困難；另外名字中出現的非字母、數字、下劃線、點的字元都會被轉為 點 ，也需要注意，盡量只用字母、下劃線和數字。
與上一步類似，只是改為文件名，不再贅述。
數據讀入後，還需要一步格式轉換。在使用ggplot2作圖時，有一種長表格模式是最為常用的，尤其是數據不規則時，更應該使用 （這點，我們在講解箱線圖時再說）。
數據轉換後就可以畫圖了，分解命令如下：
熱圖出來了，但有點不對勁，橫軸重疊一起了。一個辦法是調整圖像的寬度，另一個是旋轉橫軸標記。
設置想要的顏色。
調整legend的位置。
調整背景和背景格線以及X軸、Y軸的標題。
合並以上命令，就得到了下面這個看似復雜的繪圖命令。
圖形出來了，就得考慮存儲了，
至此，完成了簡單的heatmap的繪圖。但實際繪制時，經常會碰到由於數值變化很大，導致顏色過於集中，使得圖的可讀性下降很多。因此需要對數據進行一些處理，具體的下次再說。