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❶ TCR基因修飾的細胞毒性T淋巴細胞構建

細胞毒性T淋巴細胞（CTL）是機體抗腫瘤和抗病毒感染的關鍵效應細胞，CTL通過T細胞受體（TCR）特異識別靶細胞表面MHC-I 與抗原多肽形成的復合物，進而釋放穿孔素、顆粒酶等生物活性物質對靶細胞進行溶解。鑒於CTL在治療腫瘤和病毒性疾病中的潛在作用，對CTL的基礎與應用研究備受關注，大多研究集中於對TCR基因的改造。隨著分子生物學的發展，TCR基因克隆、轉導技術已較成熟，研究方向主要是如何保證TCR基因高效、正確表達組裝成為具生物活性的分子。

機體免疫防禦主要由體液免疫與細胞免疫兩大系統構成，其中以CD8+T淋巴細胞介導的細胞免疫在抗腫瘤過程中發揮重要作用。CD8+T從靜息性T細胞活化為具有特異殺瘤作用的細胞毒性T淋巴 細胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL)經過如下3個關鍵步驟：第一步是抗原加工與提呈，主要由專職抗原提呈細胞樹突狀細胞（dendritic cell, DC)負責; 第二步是識別與活化，CD8+ T細胞通過其表達的T細胞受體(T cell receptot, TCR)特異識別DC提呈的MHC-Ⅰ-多肽復合物，接受T細胞活化的第一信號，DC表面豐富的免疫共刺激分子給予T細胞活化的第二信號;第三步是識別與殺傷，活化的CTL通過TCR特異識別瘤細胞表面MHC-1-多肽復合物，釋放穿孔素和顆粒酶等生物活性物質溶解瘤細胞，或通過Fas-FasL途徑誘導瘤細胞凋亡。CTL的TCR對腫瘤抗原的識別是發揮其效應的基礎，抗原識別的特異性取決於TCR結構的多肽性。越來越多的研究小組利用現代分子生物學技術克隆能識別特定抗原表位的TCR基因，構建TCR基因病毒載體再轉染外周CD8+ T細胞，將之修飾成為能識別特定靶抗原的CTL。體外大規模擴增經TCR基因修飾的CTL，將為腫瘤及傳染性疾病提供新型、特異的治療手段。

TCR是T細胞表面能夠特異性識別抗原表位和介導免疫應答的分子，TCR的多態鏈依編碼基因不同命名為α、β、γ、δ鏈，分別形成αβTCR和γδTCR。 人外周血中約95%為γδTCR，約5%為αβTCR。

TCR分子是由兩條糖基肽鏈通過二硫鍵組成的異二聚體。所有α、β、γ、δTCR肽鏈均可分為胞外、 跨膜(TM)和胞質(Cy)3部分。胞外部分又分為可變區（V）、高變區（D）、結合區（J）和恆定區（C）。α鏈 由V、J、C基因編碼，β鏈由V、D、J、C基因編碼。兩鏈不同區域等位基因的重排決定了TCR的多態性，賦予了T細胞識別不同抗原的巨大潛力。TCRα和β肽鏈可變區存在4個氨基酸高變區（hypervariable region, HVR），亦稱互補決定區（complementarity determining region, CDR），其中CDR1、CDR2，CDR3又稱為超變區，是抗原特異性結合部位。TCR多態性主要由CDR3決定。

克隆TCR基因的關鍵是分離到具有高親和力的識別抗原肽的T細胞克隆。已經有多個課題組利用不同技術從不同來源獲得CTL克隆。Morgan等從黑色素瘤患者的腫瘤浸潤性淋巴細胞中分離出能識 別MART-1抗原表位的T細胞克隆。Zhang等從慢性丙型洞譽肝炎患者外周血中分離得到HCV特異性的CTL克隆。Morgan等運用HLA-A2限制性多肽體外致敏預先免疫該多肽患者的外周血淋巴細胞 （peripheral blood lymphocyte, PBL），然後用有限稀釋法獲得CTL克隆。Varela-Rohena等運用噬菌體展示技術分離抗原特異性TCR。利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）、反轉錄PCR （reverse transcription PCR，RT-PCR）技術克隆上述TCRα、β鏈全長基因。利用基因掃描技術對TCR CDR3區域進行分析，了解其可能存在的亞家族。 Meyerhuber等運用此方法從HER2(369-377)特異性CTL中成功克隆了TCR基因。

目前在TCR基因轉染過程中報道較多的是運用逆轉錄病毒載體。逆轉錄病毒載體有多方面優勢，感染細胞范圍廣，不僅適用於單層培養的細胞，而且適用於懸浮培養的淋巴細胞;機體對滲粗載體產生的免疫反 應較低，在宿主內可以穩定遺傳;往往以低拷貝整合，避免了基因重排;經特納喊段殊構建的反轉錄病毒載體是缺陷型的，比較安全;選擇不同的外殼蛋白進行包裝，可賦予病毒特定的宿主選擇性，從而達到靶向導入的目的。

Morgan等從黑色素瘤患者的腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）中獲得能識別 MART-1抗原表位的CTL克隆，從中克隆到TCR基因，利用逆轉錄病毒載體將該基因轉導入至人外周血 T淋巴細胞，經體外擴增後治療17例Ⅳ期黑色素瘤患者，15例患者在治療2個月後循環T細胞數量至少增加了10％，2例患者病情得到控制，在18個月內未復發。Parkhurst等將癌胚抗原（carcino-embry-onic antigen, CEA）特異性TCR構建入逆轉錄病毒載體轉導人外周血淋巴細胞，在TCRα鏈CDR3區域引入單核苷酸突變，增強了TCR的親和性。臨床試驗對3例轉移性結直腸癌患者進行治療，結果所有病例血清CAE水平均有所下降（74％~99％）。

目前較常用的逆轉錄病毒載體為Moloney小鼠白血病病毒改構的各類逆轉錄病毒載體，理論上它能轉染幾乎100％的靶細胞，但實際的轉染效率遠低於此。近年來人們通過各種改良方法不斷提高逆轉錄 病毒載體轉染效率。Yang等運用高速離心法濃縮病毒，4℃，6000rpm，過夜，可使病毒滴度提高50~100倍，進而提高轉染效率。研究人員利用逆轉錄病毒載體將TCRαβ基因轉導人初始T細胞,發現在相同的病毒滴度下，以骨髓瘤病毒（myeloproliferative sarcoma virus,MPSV）或鼠幹細胞病毒（murine stem cell virus, MSCV）為基礎載體比以小鼠白血病病毒（murine leukaemia virus, MLV）為基礎的載體有高轉染效率和高TCR表達。

改良的逆轉錄病毒載體已被多個研究組用於不同腫瘤相關抗原特異性TCR基因轉移中。但逆轉錄病毒只能感染分裂期細胞，容納外源基因的DNA片段長度不超過8000bp，病毒滴度低，有的反轉錄病毒可能具有激活癌基因的危險。

慢病毒載體其優點在於可有效轉染分裂和未分裂細胞;能穩定整合到靶細胞的基因組中;可轉移約 8000~10000bp基因片段;能持久穩定表達外源基因，不易導致基因沉默;沒有整合位點偏好性。

Yang等將識別MART-1和gp100的TCR基因重組入VSV-G假型第3代慢病毒載體，轉染外周T細胞，轉染細胞出現了特異性抗瘤活性，包括釋放γ干擾素和溶解瘤細胞。2010年該課題組運用CD3抗體和PBL飼養細胞預刺激T細胞，明顯提高T細 胞轉染效率，12 d內CD8+ T細胞數量擴增達600倍，且具有特異性殺傷活性和記憶性。Stauss等對比逆轉錄病毒載體與慢病毒載體轉移WT-1特異性TCR研究表明，慢病毒載體相對比較安全，可獲得較高轉染效率。Canderan等設計了雜合非小細胞肺癌特異性TCR，該TCR是由人TCRV區和鼠TCRC區嵌合而成，後將該TCR構建入慢病毒載體轉導T 細胞前體，產生特異性CD4＋ CD8＋可穩定表達雜合TCR，T細胞體外增殖良好，並可特異性識別非小細胞肺癌。雖然慢病毒載體有較多優勢，但存在有毒力恢復、垂直感染等潛在的安全隱患，仍需要臨床更多的深入研究。

將外源基因直接用理化方法轉導入靶細胞。常用的轉導方法有電穿孔技術、磷酸鈣共沉澱法、脂質體介導法、顯微注射法等，其對外源基因片段大小無要求，安全性很高，但轉染效率很低。

TCR基因轉染的載體主要還是病毒載體，但研究人員一直都在嘗試尋找更理想載體系統。值得一 提的是，「睡美人」（sleeping beauty, SB）轉座子系統已被應用於TCR基因轉移過程中，Peng等報道， 該方法TCR轉導效率可與病毒載體相媲美，但該系統缺陷在於存在整合位點偏好性，這將是其應用於臨床前亟待解決的問題。

研究人員將TCRα和β兩條鏈分別構建入兩個獨立病毒載體中，因為編碼CR單鏈基因的小病毒載體容易包裝，可獲得較高的病毒滴度。但為了得到功能性的TCR，含有α和β兩條鏈的兩個病毒顆粒必 須同時轉染同一個T細胞。這種雙感染容易增加插入突變的風險，此外，引入TCR單鏈易形成內源與外源TCR鏈的雜合體。Dossett等用不同的啟動子來調控TCR兩條鏈的表達，其中TCRα鏈受控於一 個長末端重復序列（long terminal repeat, LTR）元件，該元件也驅動報告基因neo的表達，TCRβ鏈的表達由雜合HTLV-I/SV40啟動子SRα來驅動。該方法易受啟動子的干擾，導致TCR表達下調。Wang等將HC/2G-1 TCR兩條鏈由一個內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site, IRES）原件連接，在一般啟動子啟動下作為一個單一轉錄盒來表達。IRES原件可以保證TCR兩條鏈同時表達，但IRES5′端基因通常較3′端基因表達量高，會導致突變的發生。 Chinnasamy等將TCR基因兩條鏈通過一個源自 微小RNA病毒的肽原件2A（2A peptide, p2A）來進行連接。這種連接方式可以產生一條單一的編碼TCRα和β鏈的mRNA。翻譯時，核糖體可跳過2A肽序列，從而產生兩條單獨的肽鏈：TCRα-2A融合蛋白和甘氨酸TCRβ，這種連接方式可以等量表達TCRα和β鏈，此外肽序列要比IRES原件短，構建的病毒載體較小，容易包裝，可獲得較高病毒滴度。

TCR組裝和表達是一個復雜的過程，在細胞表面進行表達之前，TCRα鏈和β鏈首先形成異源二聚體，然後與CD3復合物在內質網結合，最終TCR CD3復合物由內質網釋放後轉移至細胞膜，在這個過程中會有諸多因素影響TCR的表達效率。

密碼子優化是指用人類基因組中常見的同義密碼子置換非常見密碼子。已有證據表明，密碼子優化的TCR基因在轉導T細胞中表達水平比野生型TCR基因有所提高，從而增強其體內功能。但是，密碼子優化可能產生免疫源性TCR，此過程也可能會伴隨多肽序列的改變產生另一種開放讀碼框，有一定風險。

TCR基因轉移載體構建時最好使用單病毒載體，可以同時編碼TCRα鏈和β鏈，這樣可以防止插入突變和轉導T細胞僅表達引入的1條鏈，可以減少引入鏈與相應內源性TCR鏈誤配的風險。如果存在TCR其中1條鏈供應不足的情況，會削弱TCR異源二聚體的聚合細胞表面表達。近年來，研究人員運用IRES序列或者P2A，連接TCRα鏈和β鏈構建載體，很大程度上克服了載體配置造成的兩條鏈表達不均衡的問題。

有效的細胞表面TCR表達需要穩定的TCR CD3復合體構建。沒有CD3的情況下，TCR不能聚合而被降解。因此向T細胞內引入外源性TCR時，CD3分子的存在是主要限速步驟。競爭可降低引入性TCR細胞表面表達。 引入性TCR的表達水平通常比內源性TCR低，內源性TCR可以削弱轉導T細胞對低濃度TCR識別抗原的反應活性，這一結果驗證了引進TCR與內源性TCR競爭有限的CD3分子。 Sachiko等通過小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）的表達使內源性TCR沉默以提高外源性TCR基因的表達和活性。最近研究表明，帶有編碼TCR α和β鏈基因載體與另一個編碼CD3γ、δ、ε、ζ基因的載體進行雙重轉導CD8+T細胞，可以提高CD8+T細胞活性。

有研究表明單獨α或β鏈轉導T淋巴細胞可導致外源性TCR鏈和內源性TCR鏈混合二聚體的形成。外源性TCRα或β鏈與內源性TCRα或β鏈的誤配導致目標TCR自身配對減少，從而影響TCR的親和性。此外，誤配二聚體的形成可能會導致自身免疫反應等安全問題。Thomas等將TCR恆定區鼠源化，或進行半胱氨酸修飾產生分子間二硫鍵，發現均可提高外源性TCRα和β鏈的正確配對。 Voss等在TCRα和β鏈恆定區插入一對相互作用氨基酸，改變TCR恆定區二級結構（從「knob-into-hole」構象變為「hole-into-knob」）來提高兩條鏈的正確配對。

盡管目前TCR基因修飾CTL的基礎與臨床研究均取得較好進展，但仍存在一些問題，如功能性TCR的正確表達、TCR表達效率、TCR基因修飾CTL的親和力與體內有效性和存活時間、臨床安全性等均需要深入研究。

❷ 為甚麼人老後會死

老死的原因是因為我們的細胞老化至不能自我復原或不能再次分裂新細胞，新陣代謝率降至非常之低，直至細胞死亡。 或者你會進一步問，為什麼細胞會老化
究竟人的壽命及細胞老化有何關系? 答案就在我們的DNA*之中(DNA又稱去氧核糖核酸，共有23對染色體
是一種分子，可組成遺傳指令，以引導生物發育與生命機能運作)
好像太深了
其實可以簡單點說
我們的成長就是全靠DNA作出細胞分裂指令
你每條DNA後面都有一段東西
每次DNA分裂時都會自動減短
若不計意外之死亡
那麼
DNA就不斷分裂
那段東西就愈用愈短
最後DNA那段東西用完了便不能再次分裂了
這就是為何有些細茄野運胞會衰老的原因。 世界上所有生物都是由細胞組成，細胞是十分重要的，因為細胞內儲存了很多種不同的顫梁資料。有些細胞如果受到損害，它們會自動復原，但另一些細胞是不會復原的，例如腦細胞；當細胞不能復原，細胞所屬的器官便漸漸會失去功能。在這情況下，身體便不能正常地運作，功能會慢慢衰退而死亡。 人類死亡有兩大原因：疾病和退化。外來因素如細菌會損害人類體內的細胞，如果細胞不能復原，那部分器官便開始失去它的功用（身體內每個器官都有它獨特的功能），這樣便會影響整個身體的正常運作。如果身體不能正常運作，我們便會死亡。 另外一個因素是細胞退化，每個細胞都知道它們的壽命，這個現象稱為Program Death，當細胞運作一段時間後，細胞便開始疲勞、衰退以至死亡。這時脊渣候器官慢慢失去功能，這樣我們便會退化而死。 其實世界上任何一種生物都會死，不過有不同的壽命，有些是短短的一兩天，有些可長達百年多，但是最終都會死亡。
因為主控生命成長成熟的遺傳基因發育已經飽和
已經好比果實一樣的熟透了! 加上人就是因為會死
地球人資源才尚且可以充裕地給予人類活命同使用
否則一早已經耗盡了! 如果人不會死的話
牛頓𠮶個時代的人口總和同現在地球人口同將來世世代代人口加加埋埋
真系難以想像的大大鑊
人口密度大到難以想像的大大鑊! 蝦就算不被人果腹
亦會老去! 人即使唔會死
亦有意外致命! 如果人不會死
啲物質生活好理想的富豪
亦有工人代努
而他們暗中的黑心所為同自私行為
即使引致他人反抗他
他們亦有真正聰明的大隻保安保護同種種的可免除一切致命危機情況出現等等
而人人的遺傳基因的優秀程度又有不同
咁世界仲比依家更更唔公平! ....如果人不會死的話
壞人們
又點會惡有惡報! 如果壞人壞得有錢起來
咁就可以更壞啦!咁多壞人
監獄可以容納超多人嗎?系咪想個個國家都要有死刑呀?
參考: 你唔見BB大得好快嘅咩?
.myblog.yahoo/dionysos113/article?mid=1480 .myblog.yahoo/dionysos113/article?mid=103 .myblog.yahoo/dionysos113/article?mid=73 2011-03-08 09:47:20 補充： 八戒： 當你發咗達，做咗皇帝，就唔想死．．．．想好似我咁，返老還童。
因為身體機能下降
容易有大病
because 生老病死!!!!
參考: the teather teach

❸ 網路星期一的DNA測試：以下是這些測試可能告訴你的

商業DNA測試工具使用基因分析來提供用戶對他們的祖先和家族歷史的洞察。祖先DNA）

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最初發表在《生命科學》雜志上

❹ 看了這些書架設計，才知家裡的有多out！

心愛的書當然得給它找一個最好的書架，這些是設計師們精心設計的書架有你喜歡的嗎？不僅僅可以給你心愛的書本一個容身之處，還分分鍾提升房間的藝術感！
1Superman經典標志，除了書還能夠放一些裝飾物，珍藏的模型等等，粉棚肆薯絲們怎麼能錯過這個。
2用鋼架，木頭和金屬絲製作而成的書架，讓你的書「懸浮」在空中，如果你的藏雹頌書量相當客觀，大概只能選幾本最愛放在這里了。
3便攜可移動書架，只需要一個有掛鉤的地方，它就可以給書本雜志一個家。卧室床頭，辦公室，甚至是在廚房，隨時隨地hold住你的書。
4酷似女性的面部的書架，多個隔斷滿足大量書籍和裝飾物的擺放，不同顏色搭配不同室內裝修風格，組裝起來難度也不大。
5DNA造型的書架MYDNA，它的設計師表示，就像DNA決定了我們每個人與生俱來的特點一樣，放在MYDNA書架上的書可要精心挑選哦，它們足夠展現一個人的個性。
6像雨滴下落一樣的書架，書本就藏在這些拐角處，沒有規律的擺放方式讓它像更一件絕妙的藝術品。
7
雲朵造型的書架，有四種放置方式，至於中間如何隔斷，全靠你的想像力了。
8
這是茶幾嗎？當然不。這款書架，既可以將書掛在橫欄上，也可以直接將書放在上面，底座也是很鏈者棒的收納處。
9掛在牆上的書架，一端放書，另一端放植物，為牆壁多添一絲生氣。
10
在牆上快要飛起來的書架們...
11
從地下「長」出來的書架們，它們會不會成為你最喜歡的樹呢？
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幾何元素完美融入的書架們。

❺ ATAC-seq應用案例解析

真核生物中，DNA纏繞在組蛋白八聚體上形成染色質的基本結構單位——核小體，進而高度折疊形成染色質，最終被包裝入細胞核中。高度折疊的染色質結構對其包裝進細胞核纖譽棗是必要的，然而DNA的復制和轉錄等過程都需要打開染色質的緊密結構。染色質開放性可以反映出染色質轉錄活躍程度及結合的其他DNA修飾信息，特定條件下的染色質開放性變化可以提供大量的基因表達調控信息，為蛋白結合新位點的研究提供了方向。

文獻案例

研究背景：成人心臟是一個低再生潛能的器官。急性心肌梗死後的心力衰竭是心肌細胞不能增殖和補充丟失的心肌而導致的主要死亡原因。雖然斑馬魚已經成為研究內源性心臟再生的有力模型，但心肌細胞通過分解肌節、增殖和重新填充受損區域來應對損傷的分子機制尚不清楚，對其染色質景觀和表觀遺傳障礙的調節還不了解，而必須克服這些障礙才能使心臟再生發生。

研究方法：作者利用ATAC-Seq首次發現在冷凍損傷後，再生心肌細胞染色質可及性格局發生了廣泛的變化。通過生物信息學和基因表達分析，發現AP-1結合位點是心臟再生過程中獲得可及性區域中含量最高的基序，並使用特異性顯性負性方法，發現阻斷 AP-1 功能導致了心肌細胞增殖缺陷，以及 fbxl22  和 ilk 位點染色質可及性的降低，並利用RT-qPCR及TF足跡等實驗及分析證實這兩個靶基因分別調節肌節的分解和心肌細胞向損傷區域的突起。此外，研究還通過進一步實驗證明過表達AP-1家族成員 Jun b 和 Fosl1 可以促進哺乳動物虛擾心肌細胞體外行為的改變。

研究結果：

1. 心肌細胞染色質可及性景觀在再生過程中發生重大變化

利用ATAC-seq技術對再生心肌 Tg （gata4： EGFP +CMs） 及未損傷細胞 T g (myl7：nucDsRed) 進行分析，對鑒定出的差異上、下調peak相關基因進行GO分析發現：上調peak相關基因在調節生物過程中富集，如細胞遷移、調節細胞對刺激的反應和細胞骨架組織；下調peak相關基因則在肌原纖維組裝等生物過程中富集。再生心肌細胞染色質可及性更高的基因區域的KEGG分析揭示了參與PDGF、Wnt和整合素信號通路的基因富集。因此作者認為染色質可及性變化很可能是激活多個基因和信號通路的先決條件，而其中一些先前已被證明與斑馬魚心臟再生有關。

為了確定可能招募染色質重塑酶以控制CM中染色質景觀的轉錄因子，作者對上調的peak區域進行了轉錄因子基序分析，並結合分析之前已發表的斑馬魚在冷凍損傷後多個時間點的RNA-Seq心室的數據及RT-qPCR結果，發現多個 j un / f os 基因（AP-1 轉錄因子家族）響應成人心臟的CMs冷凍損傷而上調。通過TF足跡對比分析小鼠ATAC-Seq數據發現：在斑馬魚CMs中表達的AP-1家族成員（ junba / bb和 fosl1a ）在心肌梗塞後的小鼠邊界區CM 中沒有高度表達或上調。

2. AP-1對於斑馬魚心臟再生是必需的

由於在CMs再生過程中有多個 jun/fos 基因的表達，作者利用顯性負轉基因系，以組織特異性的方式抑制所有AP-1轉錄因子的功能（研究表明顯性陰性基因 A - F os 在多種情況下都能抑制AP-1轉錄因子的功能），並結合免疫染色及PCNA/Mef2聯合免疫染色方式的結果，最終認為：AP-1轉錄因子功能對於CM的去分化和增殖以及隨後的瘢痕消退是必需的，在CM再生中起關鍵作用並調控CM的關鍵過程，包括肌毀拆節解體和CM突入損傷區域。

為了鑒定導致CM:A-Fos(+)心臟不能再生的靶基因，作者進行了再次的ATAC-Seq分析，結合轉基因品系樣本和RT-qPCR 結果，認為：AP-1轉錄因子可促進未受損CMs中染色質可及性的變化，與再生CMs相似。

3.推測AP-1靶基因 fbx122 可促進心肌細胞肌節的解體

通過對數據的分析，作者鑒定出AP-1的可能靶基因 fbxl22 ，並通過RT-qPCR證實了其表達上調；TF footprint IGV可視化發現：相較於CM：A-Fos(-)CMs，CM:A-Fos (+) CMs中保護DNA不被轉座酶切割的保護作用減弱，與AP-1結合的喪失有關。結合實驗驗證，發現 fbxl22 是AP-1轉錄因子的靶點，進一步實驗研究表明 fbx122 在斑馬魚CMs 中的過度表達可以促進肌節蛋白降解。

4.推測AP-1靶基因 ilk 可促進心肌細胞向損傷區突起

作者在數據分析假定的AP-1靶基因，整合素連接激酶( ilk ) ，並通過RT-qPCR及TF 足跡分析證實 ilk 是AP-1靶基因，可促進心肌細胞向損傷區域突起，並通過進一步實驗驗證AP-1轉錄因子可以調節哺乳動物的心肌細胞行為。

5.JUNB和FOSL1可以調節哺乳動物心肌細胞(CM)的行為

為了確定AP-1轉錄因子是否也能調節哺乳動物CM行為，作者利用 GFP、Junb、Fosl1、Junb+Fosl1 mRNA分別轉染原代大鼠新生兒心肌細胞培養物，結合RT-QPCR、免疫印跡和免疫染色及驗證實驗，發現在哺乳動物CMs中，心肌梗塞後通常不上調或高表達的AP-1家族基因 Junb+Fosl1 的過表達導致了CMs行為的改變，這與斑馬魚CMs再生過程中發生的行為變化相似（包括CM增殖和CM突出）。

結論：AP-1 轉錄因子通過調節染色質可及性改變，從而激活促進心肌細胞去分化、增殖和突入損傷區域的基因表達程序，在心肌細胞損傷反應中發揮重要作用。

❻ 黑芥子酶 擬南芥芥子酶基因TGG6是花特異表達的假基因

摘 要：芥子酶是一類催化硫代葡萄糖苷水解的同工酶，TGG6是在擬南芥中新發現的芥子酶基因，從擬南芥幾個不同生態型中克隆了TGG6基因的全長核基因和cDNA片段，序列分析結果表明，所有供試的生態型的TGG6基因都與擬南芥第3個芥子酶基因TcC3類似，在編碼區存在1個以上移碼突變，不能編碼完整多肽。生態型Col-O第10個�含子的剪切邊界還發生了缺失，導致內含子不能被切除，初步確定TGG6是一個假基因，然而，RT-PCR結果卻表明TGG6在花器中特異性表達，說明TGG6在進化的掘灶某個階段可能是有功能的基因，由於某種原因，該基因在進化過程中被失活。
關鍵詞：擬南芥：芥子酶；TGG6；組織特異表達；花特異表達；假基因
中圖分類號：Q78文獻標識碼：A文章編號：1007-7847(2007)04-0316-07

隨著更多物種基因組測序計劃的展開或完成，人們對假基因的概念及其意義有了更新的思考，並成為基因組學研究的一個熱點，假基因(pseUdogene)被定義為核苷酸序列與相應正常功能基因相似的，但不能合成功能蛋白質的失活基因，假基因最初由jacq等人提出。他們在非洲爪蟾DNA中克隆了一個5S rRNA相關基因，在與其相應功能基因比較後發現，這個基因的5′端有16bp的缺失以及14bp的錯配，不具有正常5S rRNA的功能，因此，將這個截短的5SrRNA的相關基因描述為蘆簡假基因，隨著人類基因組計劃的完成和後基因組計劃的實施，對占人類基因組約90％的非編碼序列的研究已經展開，預計人類基因組中有約20000種假基因，在線陪散褲蟲、果蠅以及酵母等生物中也發現大量假基因，假基因保留了祖先功能基因的殘余拷貝，為研究生物進化和基因組動態變化，分析基因復制與突變等事件的年代以及頻率，揭示基因組DNA替換、插入和缺失等事件的機制提供了重要線索，此外測定假基因的分布可為新基因的預測以及鑒定提供更好的幫助。
芥子酶(myrosinase，EC3.2.1.147)是一類硫代葡糖苷酶，主要分布在白花菜目植物中，專一降解硫代葡糖苷，芥子酶和硫代葡糖苷分別儲藏在不同的細胞中，當植物受到昆蟲或病源傷害時，芥子酶將硫代葡萄糖苷水解為異硫氰化合物、硫氰化合物、腈或(口惡)唑烷硫酮等有毒物質，抵禦病蟲侵襲，因此認為「芥子酶／硫代葡萄糖苷」系統是植物重要的防禦系統，目前已在15個科500多種雙子葉植物中檢測到芥子酶活性，其中，對十字花科作物的芥子酶研究得較多，油菜和白芥等作物的芥子酶基因家族由MA、MB、MC 3個亞家族組成，共20多個基因，其中部分基因已被證實為假基因」。
在擬南芥中，最初認為只有3個芥子酶基因，其中第3個基因TGG3被證實為花特異表達的假基因，由於3個基因都不在根中表達，人們卻檢測到根提取物的芥子酶活性，因此推測存在更多的芥子酶基因，2001年Nitz等分離到一個根特異表達的葡萄糖苷酶基因Pyk10，由於與芥子酶基因相似性高，認為是芥子酶基因，但是由於沒有酶活性測定證據，而且Pyk10不具備芥子酶關鍵特徵位點，因此Pyk10不一定是芥子酶基因，通過Blast分析，我們發現了3個序列高度相似的基因具有芥子酶基因的特徵，分別命名為TGG4、TGG5、TGG6，其中TGG4、TGG5在根部特異表達，酵母表達產物具有芥子酶活性，證明是芥子酶基因(待發表)，TGG6在DNA序列上與TGG4和TGG5高度相似，但是在根部檢測不到表達。使用TGG4和TGG5的cDNA序列與GenBank中的TGG6基因組DNA序列比對，個別內含子的剪切邊界很難確定，因此難以斷定TGG6是否是有功能的基因，本研究同時從擬南芥幾個生態型克隆了TGG6的核基因和cDNA，通過生物信息學分析，發現TGG6存在移碼突變和內含子剪切邊界的突變，不能合成有功能的芥子酶，具有假基因的特徵，因此推測TGG6是一個假基因。

1材料與方法

1．1擬南芥生態型和種植方法
本實驗所使用的生態型Col-O、Ba-O、Ws-O來自Nottingham Arabidopsis Stock Center，England，JM1、JM2由作者實驗室收集保存，種子播種在標准營養土上，4℃放置3d後轉到培養室培養，培養室溫度20℃，光照16h/d，光照強度5000lx，

1．2總DNA的提取和，GG6基因的克隆
取擬南芥5種生態型植株的葉片，液氮研磨，採用大連寶生物公司總DNA提取試劑盒提取總DNA，以基因特異引物G6F1(5′-ACCCGCTGAAAAGCTCCATCAA-3′)，G6R1(5′-GGCTYCCACTYATITYGCAATGAACC-3′)擴增TGG6基因組DNA，引物由上海閃晶生物公司合成，DNA聚合酶LATaq來自大連寶生物公司，PCR產物克隆在pMD-19T載體中，轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α，酶切鑒定後，由上海閃晶生物公司測序，每個生態型TGG6基因至少測3個克隆，以排除PCR錯誤對序列的影響。

1．3RNA提取和反轉錄
分別取新鮮的擬南芥根、莖、葉、花、子葉和綠色角果約50mg，液氮迅速研磨，加入500μLTrizol試劑，劇烈震盪，按照上海申能博彩公司的3S Trizol T0tal RNA Isolation Kit試劑盒說明書進行提取，電泳檢測各樣品的總RNA質量和濃度，以5μL RNA為模板，合成第一鏈cDNA，按照上海生工AMV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書的方法進行，eDNA的合成過體系如下：在一個Eppendorf管中，加入各個組織的總RNA 5μL，oligo(dT)lμL，RNase-Free H2O 6μL，輕彈混勻離心後置於70℃變性5min，立即取出放置冰上30s，然後加入以下試劑：緩沖液4μL，dNTP 2μL，RNase inhibitor 1μL，輕彈混勻離心後37℃反應5min，再加入AMV反轉錄酶1μL，37℃水浴1h，70℃/10min終止反應。

1．4TGG6基因在擬南芥各器官組織中的表達分析
以上述第一鏈cDNA為模板，用半定量PCR方法擴增TGG6 cDNA，在基因轉錄水平探討JPTGG6基因在擬南芥植株中的表達情況，PCR反應體系(50μL)：擬南芥cDNA 100ng(1.5μL)，dNTP 4μL，10×PCR buffer 5μL，上游、下游引物G6F1、G6R1各1姓，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 37μL，反應條件如下：95℃，2min；94℃，30s，56.3℃，45s，72℃，1min 30s，30個循環； 72℃，7min結束反應，以Actl基因的表達作為參照，Actin基因的引物序列為：5′-GGCAAAAGGATGCTFATGTTGG-3′，5′-ATITCACGCTCTGCTGTGGTGG-3′，反應結束後取5μL進行電泳檢測，照相。
PCR陽性的產物純化後，連接至pMD-19T載體，進行藍白斑篩選挑取陽性克隆，酶切鑒定後送上海閃晶生物公司進行序列測定。

2 結果與分析

2．1生態型Col-O的TGG6基因的失活突變
植物芥子酶基因一般都由12個外顯子和11個內含子組成，TGG4和JP7GG5代表一個芥子酶基因新家族，其基因由13個外顯子和12個內含子組成(待發表)，TGG6基因序列與TGG4和TGG5相似型較高，基因結構也相似，由13個外顯子組成，不過，將生態型Col-O的TGG6核基因序列、cDNA序列與TGG4、TGG5基因序列比較發現，在TGG6中存在4個移碼突變，包括第1個外顯子中2個鹼基的插入突變、第6個外顯子中1個鹼基的插入突變、第9個外顯子中4個鹼基的缺失突變以及第12個外顯子中17個鹼基的缺失突變(圖1)，這些突變都使TGG6基因不能編碼正確的芥子酶，此外，Col-0的TGG6基因的第10個內含子的3』端剪切邊界區域發生9個鹼基的缺失突變(與TGG4比較)，導致第10個內含子保留在cDNA中，未被剪切。有趣的是，TGG6第10個內含子的5′端的剪切邊界與JP7GG4和JPTGG5-樣，是一個異常邊界「GC」。



2．2 TGG6在花中特異表達
以擬南芥生態型Col-O為材料，從不同器官中提取總RNA，結果如圖2所示，由圖2可以看出RNA條帶整齊，完整性良好，可以滿足後續試驗的要求。
說明第6個外顯子的插入突變是TGG6基因最早發生的基因失活突變，它發生在擬南芥生態型分化之前，而其它位點的突變發生在JMl、JM2與Col-0等生態型的分化之後。

RT-PCR結果(圖3)表明，TGG6基因在花中特異表達，在子葉、根、莖、葉和角果中都檢測不到表達。

2．3 不同生態型TGG6基因的克隆及多態性分析 分別從Col-O、JMl、JM2、Ws-O、Ba-O等擬南芥生態型克隆TGG6基因組DNA和cDNA，測序後進行序列比較，結果發現，生態型Ws-O和Ba-O與Col-O序列相似性接近100％，具有Col-O的所有移碼突變以及第10個內含子的剪切邊界缺失，但生態型JMl和JM2僅具有第6個外顯子的1個鹼基的插入突變，其它突變位點都正常(表1)。

3 討論

在過去的幾十年中，假基因一直被認為是分子化石，是進化中基因突變的遺跡，沒有功能，屬於「垃圾基因」，與相應的正常基因相比較，假基因缺少正常基因的內含子，兩側有順向重復序列等，大多數假基因本身存在著多種遺傳缺陷，例如早熟終止密碼以及移碼突變等等，因而它們的表達受到了抑制，但是近來科學家發現假基因並不是「垃圾基因」，假基因在基因表達、調控以及產生基因多樣性等方面可能都扮演著極為重要的角色，但到目前為止，其確切的作用機制仍不清楚。
目前已在擬南芥中發現6個芥子酶基因即TGG1、TGG2、TGG3、TGG4、TGG5及TGG6(TGG4、TGG5及TGG6未發表)，其中TGG1、TGG2、TGG4、TGG5已被證實是有功能的基因，TGG3是不能編碼完整芥子酶的假基因，本研究通過對5個擬南芥生態型TGG6基因的序列、結構和表達研究，發現TGG6基因在所有5個生態型中都存在第6個外顯子的插入型移碼突變，導致基因不能編碼完整的芥子酶，因此認為TGG6與TGG3一樣，是一個假基因，由於TGG6在基因序列中存在TGG4和TGG5中的所有內含子，TGG6是在基因重復發生後，再通過失活突變而形成的，然而，與TGG3一樣，TGG6也在花中特異表達，而且TGG6在所有生態型中所共有的移碼突變發生在第6個外顯子，與TGG3在所有生態型中所共有的移碼突變(第5個外顯子)的位置非常接近(圖4)，這種現象到底是必然還是巧合有待進一步研究。

TGGI3由12個外顯子組成，TGG4-6由13個外顯子組成，其差別來自在TGGl―3中的第5個外顯子在TGG4-6中被1個內含子分割為兩個外顯子，TGG6和TGG3的表達特徵與TGGl和TGG2在葉片、子葉、莖、花和角果中表達，TGG4與TGG5在根部表達形成鮮明的對比，這些信息暗示TGG6和TGG3可能還有某種未知的功能，另外，由於TGG6和TGG3的突變發生在基因重復之後，在進化的歷史上是否還殘留著功能基因，並保存在某個地區的某種生態型中?TGG6和TGG3為什麼要發生突變?突變被自然選擇所保留的生物學意義是什麼?這都是今後研究必須回答的問題。

作者簡介：汪萌(1981―)，女，山東聊城人，碩士研究生，主要從事生物化學和分子生物學研究；張家明(1966―)，男，湖北公安人，熱帶生物技術研究所研究員，博士生導師，通訊作者，主要從事作物遺傳育種和分子生物學研究。

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《基因決定我愛你》
導演: 李芸嬋
編早燃劇: 李芸嬋
主演: 余男、何潤東、關穎、彭於晏、林依輪
類型: 喜劇、愛情、科幻
製片國家/地區: 中國台灣
語言: 漢語普通話
上映日期: 2007-08-31
又名: My DNA Says I Love You
女孩四季（關穎）與瑪菱（余男）同在一家公司上班、同住一間公寓，一個攜帶對「骯臟」超族燃級敏感的潔癖基因，另一個則有肥胖基因，必須不停地吃葯才能抑制發胖，兩人均為無法與他人建立穩定的關系煩惱著。
四季重逢初戀男友食蟻獸（何潤東），兩人歡歡喜喜再續情緣之時，對方不經意間流露的邋遢令她難以繼續往前；瑪菱與男友（林依倫）一年見面的次數非常有限，渴望常情的她被隔壁住的陽光男孩小熊（彭於晏）暗戀著。為了收獲令自己真正開心的愛情，兩人決定服食葯陸穗虛物改造基因，之後，她們的基因得到修正，但新的煩惱也接踵而至。

❽ 21世紀海洋生物技術發展展望

21世紀海洋生物技術發展展望具體內容是什麼，下面中達咨詢為大家解答。
發展展望近10年來，由於海洋在沿海國家可持續發展中的戰略地位日益突出，以及人類對海洋環境特殊性和海洋生物多樣性特徵的認識不斷深入，海洋生物資源多層面的開發利用極大地促進了海洋生物技術研究與應用的迅速發展。1989年首屆國際海洋生物技術大會（以下簡稱MPS大會）在日本召開時僅有幾十人參加，而1997年第四屆IMBC大會在義大利召開時參加入數達1000多人。現在IMBC會議已成為全球海洋生物技術發展的重要標志，出現了火紅的局面。《IMBC 2000》在澳大利亞剛剛開過，《IMBC 2003》的籌備工作在日本已經開始，以色列為了舉辦們《IMBC 2006》早早作了宣傳，並爭到了舉辦權。每3年一屆的IMBC不僅吸引了眾多高水平的專家學者前往展示與交流研究成果，探討新的研究發展方向，同時也極大地推動了區域海洋生物技術研究的發展進程。在各大洲，先後成立了區域性學術交流組扒培織，如亞太海洋生物技術學會、歐洲海洋生物技術學會和泛美海洋生物技術協會等。各國還組建了一批研究中心，其中比較著名的為美國馬里蘭大學海洋生物技術中心、加州大學聖地亞哥分校海洋生物技術和環境中心，康州大學海洋生物技術中心，挪威貝爾根大學海洋分子生物學國際研究中心和日本海洋生物技術研究所等。這些學術組織或研究中心不斷舉辦各種專題研討會或工作組會議研究討論富有區域特色的海洋生物技術問題。1998年在歐洲海洋生物技術學會、日本海洋生物技術學會和泛美海洋生物技術協會的支持下，原《海洋生物技術雜志》與《分子海洋生物學和生物技術》合刊為《海洋生物技術》學報（以下簡稱MB T），現在它已成為一份具有權威性的國際刊物。海洋生物技術作為一個新的學科領域已明確被定義為「海洋生命的分子生物學如細胞生物學及其它的技術應用」。
為了適應這種快速發展的形勢，美國、日本、澳大利亞等發達國家先後制定了國家發展計劃，把海洋生物技術研究確定為21世紀優先發展領域。1996年，中國也不失時機地將海洋生物技術納入國家高技術研究發展計劃（863計劃），為今後的發展打下了基礎。不言而喻，迄今海洋生物技術不僅成為海洋科學與生物技術交叉發展起來的全新研究領域，同時，也是21世紀世界各國科學技術發展的重要內容並將顯示出強勁的伍皮發展勢頭和巨大應用潛力。
1.發展特點
1.1加強基礎生物學研究是促進海洋生物技術研究發展的重要基石海洋生物技術涉及到海洋生物的分子生物學、細胞生物學、發育生物學、生殖生物學、遺傳學、生物化學、微生物學，乃至生物多樣性和海春橘唯洋生態學等廣泛內容，為了使其發展有一個堅實的基礎，研究者非常重視相關的基礎研究。在《IMBC 2000》會議期間，當本文作者詢問一位資深的與會者：本次會議的主要進步是什麼？他毫不猶豫的回答：分子生物學水平的研究成果增多了。事實確實如此。近期的研究成果統計表明，海洋生物技術的基礎研究更側重於分子水平的研究，如基因表達、分子克隆、基因組學、分子標記、海洋生物分子、物質活性及其化合物等。這些具有導向性的基礎研究，對今後的發展將有重要影。
1.2推動傳統產業是海洋生物技術應用的主要方面目前，應用海洋生物技術推動海洋產業發展主要聚焦在水產養殖和海洋天然產物開發兩個方面，這也是海洋生物技術研究發展勢頭強勁。充滿活力的原因所在。在水產養殖方面，提高重要養殖種類的繁殖、發育、生長和健康狀況，特別是在培育品種的優良性狀、提高抗病能力方面已取得令人鼓舞的進步，如轉生長激素基因魚的培育、貝類多倍體育苗、魚類和甲殼類性別控制、疾病檢測與防治、DNA疫苗和營養增強等；在海洋天然產物開發方面，利用生物技術的最新原理和方法開發分離海洋生物的活性物質、測定分子組成和結構及生物合成方式、檢驗生物活性等，已明顯地促進了海洋新葯、酶、高分子材料、診斷試劑等新一代生物製品和化學品的產業化開發。
1.3保證海洋環境可持續利用是海洋生物技術研究應用的另一個重要方面利用生物技術保護海洋環境、治理污染，使海洋生態系統生物生產過程更加有效是一個相對比較新的應用發展領域，因此，無論是從技術開發，還是產業發展的角度看，它都有巨大的潛力有待挖掘出來。目前已涉及到的研究主要包括生物修復（如生物降解和富集、固定有毒物質技術等）、防生物附著、生態毒理、環境適應和共生等。有關國家把「生物修復」作為海洋生態環境保護及其產業可持續發展的重要生物工程手段，美國和加拿大聯合制定了海洋環境生物修復計劃，推動該技術的應用與發展。
1.4與海洋生物技術發展有關的海洋政策始終是公眾關注的問題其中海洋生物技術的發展策略、海洋生物技術的專利保護、海洋生物技術對水產養殖發展的重要性、轉基因種類的安全性及控制問題、海洋生物技術與生物多樣性關系以及海洋環境保護等方面的政策、法規的制定與實施倍受關注。
2. 重點發展領域
當前，國際海洋生物技術的重點研究發展領域主要包括如下幾個方面：
2.1發育與生殖生物學基礎弄清海洋生物胚胎發育、變態、成熟及繁殖各個環節的生理過程及其分子調控機理，不僅對於闡明海洋生物生長、發育與生殖的分子調控規律具有重要科學意義，而且對於應用生物技術手段，促進某種生物的生長發育及調控其生殖活動，提高水產養殖的質量和產量具有重要應用價值。因此，這方面的研究是近年來海洋生物技術領域的研究重點之一。主要包括：生長激素、生長因子、甲狀腺激素受體、促性腺激素、促性腺激素釋放激素、生長一催乳激素、滲透壓調節激素、生殖抑制因子、卵母細胞最後成熟誘導因子、性別決定因子和性別特異基因等激素和調節因子的基因鑒定、克隆及表達分析，以及魚類胚胎於細胞培養及定向分化等。
2.2基因組學與基因轉移隨著全球性基因組計劃尤其是人類基因組計劃的實施，各種生物的結構基因組和功能基因組研究成為生命科學的重點研究內容，海洋生物的基因組研究，特別是功能基因組學研究自然成為海洋生物學工作者研究的新熱點。目前的研究重點是對有代表性的海洋生物（包括魚、蝦、貝及病原微生物和病毒）基因組進行全序列測定，同時進行特定功能基因，如葯物基因、酶基因、激素多肽基因、抗病基因和耐鹽基因等的克隆和功能分析。在此基礎上，基因轉移作為海洋生物遺傳改良、培育快速生長和抗逆優良品種的有效技術手段，已成為該領域應用技術研究發展的重點。近幾年研究重點集中在目標基因篩選，如抗病基因、胰島素樣生長因子基因及綠色熒光蛋白基因等作為目標基因；大批量、高效轉基因方法也是基因轉移研究的重點方面，除傳統的顯微注射法、基因槍法和精子攜帶法外，目前已發展了逆轉錄病毒介導法，電穿孔法，轉座子介導法及胚胎細胞介導法等。
2.3病原生物學與免疫隨著海洋環境逐漸惡化和海水養殖的規模化發展，病害問題已成為制約世界海水養殖業發展的瓶頸因子之一。開展病原生物（如細菌、病毒等）致病機理、傳播途徑及其與宿主之間相互作用的研究，是研製有效防治技術的基礎；同時，開展海水養殖生物分子免疫學和免疫遺傳學的研究，弄清海水魚、蝦、貝類的免疫機制對於培育抗病養殖品種、有效防治養殖病害的發生具有重要意義。因此，病原生物學與免疫已成為當前海洋生物技術的重點研究領域之一，重點是病原微生物致病相關基因、海洋生物抗病相關基因的篩選、克隆，海洋無脊椎動物細胞系的建立、海洋生物免疫機制的探討、DNA疫苗研製等。
2.4生物活性及其產物海洋生物活性物質的分離與利用是當今海洋生物技術的又一研究熱點。現人研究表明，各種海洋生物中都廣泛存在獨特的化合物，用來保護自己生存於海洋中。來自不同海洋生物的活性物質在生物醫學及疾病防治上顯示出巨大的應用潛力，如海綿是分離天然葯物的重要資源。另外，有一些海洋微生物具有耐高溫或低溫、耐高壓、耐高鹽和財低營養的功能，研究開發利用這些具特殊功能的海洋極端生物可能獲得陸地上無法得到的新的天然產物，因而，對極端生物研究也成為近年來海洋生物技術研究的重點方面。這一領域的研究重點包括抗腫瘤葯物、工業酶及其它特殊用途酶類、極端微生物中特定功能基因的篩選、抗微生物活性物質、抗生殖葯物、免疫增強物質、抗氧化劑及產業化生產等。
2.5海洋環境生物技術該領域的研究重點是海洋生物修復技術的開發與應用。生物修復技術是比生物降解含義更為廣泛，又以生物降解為重點的海洋環境生物技術。其方法包括利用活有機體、或其製作產品降解污染物，減少毒性或轉化為無毒產品，富集和固定有毒物質（包括重金屬等），大尺度的生物修復還包括生態系統中的生態調控等。應用領域包括水產規模化養殖和工廠化養殖、石油污染、重金屬污染、城市排污以及海洋其他廢物（水）處理等。目前，微生物對環境反應的動力學機制、降解過程的生化機理、生物感測器、海洋微生物之間以及與其它生物之間的共生關系和互利機制，抗附著物質的分離純化等是該領域的重要研究內容。
3.前沿領域的最新研究進展
3.1發育與生殖調控應用GIH（性腺抑制激素）和GSH（性腺刺激激素）等激素調控甲殼類動物成熟和繁殖的技術[1]，研究了甲狀腺激素在金紹生長和發育中的調控作用，發現甲狀腺激素受體mRNA水平在大腦中最高，在肌肉中最低，而在肝、腎和鰓中表達水平中等，表明甲狀腺素受體在成體金銀腦中起著重要作用[1]，對海鞘的同源框（Homeobox）基因進行了鑒定，分離到30個同源框基因[1]，建立了青鱂的同源框（Homeobox）基因[1]，建立了青鱂胚胎幹細胞系並通過細胞移植獲得了嵌合體青鱂[1]，建立了虹鱒原始生殖細胞培養物並分離出Vasa基因[2]，進行斑節對蝦生殖抑制激素的分離與鑒定[2]，應用受體介導法篩選GnRH類似物，用於魚類繁殖[2]，建立了海綿細胞培養技術，用於進行葯物篩選[2]，建立了將海膽胚胎作為研究基因表達的模式系統[2]，通過基因轉移開展了海膽胚胎工程的研究[2]，研究了人葡糖轉移酶和大鼠已糖激酶cDNA在虹鱒胚胎中的表達［3］，建立了通過細胞周期蛋白依賴的激酶活性測定海水魚苗細胞增殖速率的方法[3]，研究了幾丁質酶基因在斑節對蝦蛻皮過程中的表達［4］，從海參分離出同源框基因，並進行了序列的測定[4].
3.2功能基因克隆建立了牙鮃肝臟和脾臟mRN A的表達序列標志，從深海一種耐壓細菌中分離到壓力調節的操縱子，從大西洋鮭分離到雌激素受體和甲狀腺素受體基因，從挪威對蝦中分離到性腺抑制激素基因[1]；將DNA微陣列技術在海綿細胞培養上進行了應用，構建了班節對蝦遺傳連鎖圖譜，建立了海洋紅藻EST，從海星卵母細胞中分離出成熟蛋白酶體的催化亞基，初步表明硬骨頭魚類IGF-I原E一肽具有抗腫瘤作用[2]；構建了海洋酵母De—baryomyces hansenii的質粒載體，從鯉魚血清中分離純化出蛋白酶抑制劑，從蘭蟹血細胞中分離到一種抗菌肽樣物質，從紅鮑分離到一種肌動蛋白啟動子，發現依賴於細胞周期的激酶活性可用作海洋魚類苗種細胞增殖的標記，克隆和定序了鰻魚細胞色素P4501A cD-NA，通過基因轉移方法分析了鰻細胞色素P450IAI基因的啟動子區域，分離和克隆了鰻細胞色素P450IAI基因，建立了適宜於溝紹遺傳作圖的多態性EST標記，構建了黃蓋鰈EST資料庫並鑒定出了一些新基因，建立了班節對蝦一些組織特異的EST標志，從經Hirame Rhabdovirus病毒感染的牙鮃淋巴細胞 EST中分離出596個 cDNA克隆[3]；用PCR方法克隆出一種自體受精雌雄同體魚類的？一肌動蛋白基因，從金鯛cDNA文庫中分離出多肽延伸因子EF-2CDNA克隆，在湖鱒基因組中發現了TC1樣轉座子元件[4]；鑒定和克隆出的基因包括：南美白對蝦抗菌肽基因、牡蠣變應原（allergen）基因、大西洋鰻和大西洋鮭抗體基因、虹鱒Vasa基因、青鱂P53基因組基因、雙鞭毛藻類真核啟始因子5A基因、條紋鱸GtH（促性腺激素）受體cDNA、鮑肌動蛋白基因、藍細菌丙酮酸激酶基因、鯉魚視紫紅質基因調節系列以及牙鮃溶菌酶基因等［1—4］。
3.3基因轉移分離克隆了大馬哈魚IGF基因及其啟動子，並構建了大馬哈魚IGF（胰島素樣生長因子）基因表達載體[1].通過核定位信號因子提高了外源基因轉移到斑馬魚卵的整合率[1]，建立了快速生長的轉基因羅非魚品系並進行了安全性評價；對轉基因羅非魚進行了三倍體誘導，發現三倍體轉基因羅非魚盡管生長不如轉基因二倍體快，但優於未轉基因的二倍體魚，同時，轉基因三倍體雌魚是完全不育的，因而具有推廣價值[2]；研究了超聲處理促進外源DNA與金鯛精子結合的技術方法，將GFP作為細胞和生物中轉基因表達的指示劑；表明轉基因溝鯰比對照組生長快33%，且轉基因魚逃避敵害的能力較差，因而可以釋放到自然界中，而不會對生態環境造成大的危害[3]；應用GFP作為遺傳標記研究了斑馬魚轉基因的條件優化和表達效率[3]；在抗病基因工程育種方面，構建了海洋生物抗菌肽及溶菌酶基因表達載體並進行了基因轉移實驗[2]；在轉基因研究的種類上，目前已從經濟養殖魚類逐步擴展到養殖蝦、貝類及某些觀賞魚類[2.3].通過基因槍法將外源基因轉到虹鱒肌肉中獲得了穩定表達[4].
3.4分子標記技術與遺傳多樣性研究了將魚類基因內含子作為遺傳多樣性評價指標的可行性，應用SSCP和定序的方法研究了大西洋和地中海幾種海洋生物的遺傳多樣性[1].研究了南美白對蝦消化酶基因的多態性[1]；利用寄生性原生動物和有毒甲藻基因組DNA的間隔區序列作標記檢測環境水體中這些病原生物的污染程度，應用18S和5.8 S核糖體RNA基因之間的第一個內部間隔區（ITC—1）序列作標記進行甲殼類生物種間和種內遺傳多樣性研究[2]；研究了斑節對蝦三個種群的線粒體DNA多態性，用PCR技術鑒定了夏威夷Gobioid苗的種類特異性。通過測定內含子序列揭示了南美白對蝦的種內遺傳多樣性，採用同功酶、微衛星DNA及RAPD標記對褐鱒不同種群的遺傳變異進行了評價，在平魚鑒定並分離出12種微衛星DNA，在美國加州魷魚上發現了高度可變的微衛星DNA[3]；弄清了一種深水魚類（Gonostoma gracile）線粒體基因組的結構，並發現了硬骨魚類 tRNA基因重組的首個實例，測定了具有重要商業價值的海水輪蟲的衛星DNA序列，用RAPD技術在大鯪鮃和鰨魚篩選到微衛星重復片段，從多毛環節動物上分離出高度多態性的微衛星DNA，用RAPD技術研究了泰國東部泥蟹的遺傳多樣性[3]；用AFLP方法分析了母性遺傳物質在雌核發育條紋鱸基因組中的貢獻[4].
3.5DNA疫苗及疾病防治構建了抗魚類壞死病毒的 DNA疫苗[1]；開展了虹鱒IHNV DNA疫苗構建及防病的研究，表明用編碼IHNV糖蛋白基因的DNA疫苗免疫虹鱒，誘導了非特異性免疫保護反應，證明DNA免疫途徑在魚類上的可行性，從虹鱒細胞系中鑒定出經干擾素可誘導的蛋白激酶[2]；建立了養殖對蝦病毒病原檢測的ELISA試劑盒，用PCR等分子生物學技術鑒定了蝦類的病毒性病原，將魚類的非特異性免疫指標用於海洋環境監控，研究了抗病基因轉移提高鯛科魚類抗病力的可行性，研究了蛤類唾液酸凝集素的抗菌防禦反映[2]；研究了一種海洋生物多糖及其衍生物的抗病毒活性[3]；建立了測定牡蠣病原的PCR—ELISA方法[3]；研究了Latrunculin B毒素在紅海綿體內的免疫定位[4].
3.6生物活性物質從海藻中分離出新的抗氧化劑[1]，建立了大量生產生物活性化合物的海藻細胞和組織培養技術，建立了通過海綿細胞體外培養制備抗腫瘤化合物的方法[1]；從不同生物（如對蝦和細菌）中鑒定分離出抗微生物肽及其基因，從魚類水解產物中分離出可用作微生物生長底物的活性物質，海洋生物中存在的抗附著活性物質，用血管生成抑制劑作為抗受孕劑，從蟹和蝦體內提取免疫激活劑，從海洋藻類和藍細菌中純化光細菌致死化合物，海星抽提物在小鼠上表現出批精細胞形成的作用，從海洋植物Zostera marina分離出一種無毒的抗附著活性化合物，從海綿和海鞘抽提物分離出抗腫瘤化合物，開發了珊瑚變態天然誘導劑，從海膽中分離出一種抗氧化的新葯，在海洋雙鞭毛藻類植物中鑒定出長碳鏈高度不飽和脂肪酸（C28），表明海洋真菌是分離抗微生物肽等生物活性化合物的理想來源[2]；發現海洋假單胞桿菌的硫酸多糖及其衍生物具有抗病毒活性，從硬殼蛤分離出谷光甘肽一S一轉移酶，從鯉血清中分離出絲氨酸蛋白酶抑制劑，從海綿中分離出氨激脯氨酸二肽酶，從一種珊瑚分離出具DNA酶樣活性的物質，建立了開放式海綿養殖系統，為生物活性物質的大量制備提供了充足的海綿原料[3]；從蝦肌水解產物中分離到抗氧化肽物質[4]；
3.7生物修復、極端微生物及防附著研究了轉重金屬硫蛋白基因藻類對海水環境中重金屬的吸附能力，表明明顯大於野生藻類[1]，研究了石油降解微生物在修復被石油污染的海水環境上的可療性及應用潛力[1]；研究了海洋磁細菌在去除和回收海水環境中重金屬上的應用潛力[1]；用Bacillus清除養魚場污水中的氮，用分子技術篩選作為海水養殖餌料的微藻，開發了六價鉻在生物修復上的應用潛力，分離出耐冷的癸烷降解細菌，研究了海洋環境中多芳香化烴的微生物降解技術[2]；從噬鹽細菌分離出滲透壓調節基因，並生產了重組Ectoine（滲透壓調節因子），從2650米的深海分離到一種耐高溫的細菌，這種細菌可用來分離耐高溫和熱穩定的酶，在耐高溫的archaea發現了D型氨基酸和無氧氨酸消旋酶，測定了3種海洋火球菌的基因組DNA序列，藉助於CROSS／BLAST分析進行了特定功能基因的篩選，從海底沉積物、海水和北冰洋收集了1000多種噬冷細菌，並從這些細菌中分離到多種冷適應的酶[2]；建立了一種測定藤壺附著誘導物質的簡單方法，研究了Chlorophyta和共生細菌之間附著所必需的形態上相互作用，研究了珊瑚抗附著物質（dterpene）類似物的抗附著和麻醉作用[3]；分析了海岸環境中污著的起始過程，並對沉積物和附著物的影響進行了檢測[4].
4.展望與建議
上述研究分析表明，海洋生物技術作為一個全新的學科，已成為21世紀海洋研究開發的重要領域，並沿著三個應用方向迅速發展。一是水產養殖，其目標十分清楚就是要提升傳統產業，促使水產養殖業在優良品種培育、病害防治、規模化生產等諸多方面出現跨越式的發展；二是海洋天然產物開發，其目標是探索開發高附加值的海洋新資源，促進海洋新葯、高分子材料和功能特殊的海洋生物活性物質產業化開發；三是海洋環境保護，其目標是保證海洋環境的可持續利用和產業的可持續發展。令人可喜的是這個應用發展趨勢與我國海洋產業的發展需求，特別是與我國海洋生物資源可持續開發利用的高技術需求相一致[5].事實上，在過去5年中我國海洋生物技術的研究應用已經取得了長足的進步，取得了一批具世界先進水平的研究成果，在推動海洋產業發展中發揮了重要作用。進入21世紀，加大海洋863的支持力度，進一步促進我國海洋生物技術快速發展的勢頭，不僅有現實的意義，也是具有戰略價值的舉措。另外，面對科技全球化的挑戰，多渠道地加強國際合作與交流，促進我國海洋生物技術創新和產業化向更高層面上發展也是十分重要的。
從技術應用的角度看，海洋生物技術主要是利用海洋環境特殊性和生物多樣性特徵，從分子和細胞水平上，即從高技術水平上多層面地開發利用海洋生物群體資源。遺傳資源和天然產物資源，那麼與此相關的基礎研究就顯得十分重要了。事實上，這也是一種國際研究發展趨勢。為了彌補這方面的不足，在我國海洋生物技術發展過程中需要有多方面支持和配合，不僅要與《國家重點基礎研究發展規劃》、《國家自然科學基金》等相關計劃溝通、銜接，還需要加強基礎性建設。既需要加強中試基地和產業化基地建設，也需要加強基礎設施建設，如加強開放實驗室、研究基地、生物多樣性資源庫、種子庫、信息資料庫的建設。這些措施對我國海洋生物技術向更高水平發展具有深遠意義。
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